本文關(guān)鍵詞：釀酒酵母中表達(dá)不同形式pEGF在斷奶動物體內(nèi)外生物學(xué)活性的比較研究

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【摘要】：[背景]豬表皮生長因子(porcine epidermal growth factor,p EGF)作為一種重要的乳源性生長因子之一,能夠刺激哺乳動物的小腸DNA合成及細(xì)胞增殖,促進(jìn)腸道發(fā)育,改善腸道菌群結(jié)構(gòu),從而提高其生長性能及免疫功能等。[目的]本研究分別構(gòu)建INVSc1-IE(+)(胞內(nèi)表達(dá)EGF蛋白)、INVSc1-EE(+)(胞外表達(dá)EGF蛋白)及INVSc1-TE(-)(含His標(biāo)簽EGF蛋白)三種不同表達(dá)形式的重組酵母菌,且比較分析不同表達(dá)形式EGF蛋白在斷奶SD大鼠及仔豬的體內(nèi)外生物學(xué)活性,對于研發(fā)一種更適用于畜牧生產(chǎn)及臨床醫(yī)學(xué)的基因表達(dá)方式具有重要意義。[方法](1)從內(nèi)江豬乳腺組織中克隆EGF基因,在綜合考慮釀酒酵母密碼子使用頻率和表達(dá)效率的基礎(chǔ)上,人工合成sp EGF(TAA+),Mfα-sp EGF(TAA+)及sp EGF(TAA-)全基因,構(gòu)建p YES2-sp EGF(TAA+),p YES2-Mfα-sp EGF(TAA+)及p YES2-sp EGF(TAA-)表達(dá)載體并在釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá)。對重組釀酒酵母INVSc1-IE(+)(胞內(nèi)表達(dá)EGF蛋白),INVSc1-EE(+)(胞外表達(dá)EGF蛋白)及INVSc1-TE(-)(含His標(biāo)簽EGF蛋白)的三種表達(dá)蛋白進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳、蛋白質(zhì)免疫印跡。(2)比較分析不同表達(dá)形式EGF對SD大鼠腸上皮細(xì)胞的體外增殖活性:隨機(jī)選取60只斷奶SD大鼠分成6組(每組3欄,每欄3-4只)——空白對照組(Control group)、空載體組[INVSc1(EV)]、胞內(nèi)表達(dá)EGF組[INVSc1-IE(+)]、胞外表達(dá)EGF組[INVSc1-EE(+)組]、含His的EGF組[INVSc1-TE(-)]以及陽性對照組(rh-EGF),進(jìn)行動物飼養(yǎng)試驗(yàn),飼喂16天后,測定其生長性能(如,日增重、日均采食量、飼料轉(zhuǎn)化率等)、腸道發(fā)育(如,絨毛高度、隱窩深度、黏膜總蛋白、DNA及RNA含量),血液理化指標(biāo)(如,肌酸激酶CK及乳酸脫氫酶LDH)及免疫功能(如,Ig A、Ig G及Ig M),同時采用體外培養(yǎng)及RT-PCR檢測重組酵母在斷奶SD大鼠小腸內(nèi)的存活情況。(3)在以斷奶SD大鼠為模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步比較分析不同表達(dá)形式EGF蛋白對豬腸上皮細(xì)胞體外增殖活性——選取120只21日齡斷奶的仔豬,分成5組(每組4欄、每欄6只):對照組、空載體[INVSc1(EV)]組、INVSc1-IE(+)組、INVSc1-EE(+)組及INVSc1-TE(-)組,進(jìn)行動物飼養(yǎng)試驗(yàn),飼喂21天后,測定其生長性能(如,日增重、日均采食量及飼料轉(zhuǎn)化率等)、腸道發(fā)育(如,絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度、黏膜總蛋白、DNA及RNA含量)、增殖細(xì)胞核抗原的免疫組化(PCNA)、血液理化指標(biāo)(如,肌酸激酶CK、堿性磷酸酶ALP及乳酸脫氫酶LDH)及免疫功能(如,Ig A、Ig G及Ig M),同時采體外培養(yǎng)及RT-PCR檢測重組酵母在斷奶仔豬小腸內(nèi)的存活情況。(4)在斷奶仔豬的21天試驗(yàn)中,分別取不同處理組的斷奶仔豬在0、7、14及21天的糞便,以變性梯度凝膠電泳(DGGE)檢測技術(shù)測定其16S r DNA的V3區(qū)菌群,全收糞測定飼糧養(yǎng)分表觀消化率(如,粗蛋白、粗脂肪、粗纖維及總能等)。(5)測定不同處理組斷奶仔豬的十二指腸、空腸和回腸粘膜中肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、蔗糖酶(Sucrase)及堿性磷酸酶(ALP)酶活性,采用熒光定量PCR檢測CK、LDH、Sucarase、ALP和EGF-R基因的m RNA表達(dá)水平。[結(jié)果](1)根據(jù)RT-PCR和測序結(jié)果顯示,成功地構(gòu)建了p YES2-sp EGF(TAA+)、p YES2-Mfα-sp EGF(TAA+)和p YES2-sp EGF(TAA-)三種不同表達(dá)形式的載體,并在釀酒酵母中成功表達(dá)。在Tricine-SDS-PAGE電泳及蛋白質(zhì)免疫印跡中可以分別觀察到目的條帶及印跡條帶,且在純化定量分析中,重組釀酒酵母INVSc1-IE(+)、INVSc1-EE(+)及INVSc1-TE(-)菌液中目的蛋白表達(dá)量均為30mg·L-1。(2)SD大鼠的體外生物學(xué)活性檢測結(jié)果顯示,胞內(nèi)和胞外表達(dá)EGF蛋白較含His標(biāo)簽EGF蛋白對鼠腸上皮細(xì)胞的增殖作用更顯著(P0.05);斷奶SD大鼠體內(nèi)生物學(xué)活性檢測的結(jié)果證實(shí),胞內(nèi)EGF蛋白、胞外EGF蛋白以及含His標(biāo)簽EGF蛋白較對照組和空載體組能顯著地促進(jìn)其小腸發(fā)育(如絨毛高度、隱窩深度、小腸粘膜總蛋白、總DNA及RNA含量)(P0.01),且也顯著提高其生長性能(如日增重及飼料轉(zhuǎn)化率)(P0.05),降低血液中肌酸激酶及乳酸脫氫酶含量(P0.05),增強(qiáng)其機(jī)體的免疫功能(如Ig A、Ig G及Ig M)等(0.05P0.10);進(jìn)一步比較不同表達(dá)形式在斷奶SD大鼠的體內(nèi)外生物學(xué)活性,胞內(nèi)表達(dá)EGF蛋白較胞外表達(dá)EGF蛋白及含His標(biāo)簽EGF蛋白能更顯著地促進(jìn)小腸發(fā)育,降低肌酸激酶及乳酸脫氫酶水平,提高機(jī)體免疫功能和生長性能(P0.05);重組酵母能夠存活于斷奶SD大鼠腸道內(nèi)并能被有效分解利用。(3)據(jù)斷奶仔豬的體外生物學(xué)活性檢測結(jié)果,胞內(nèi)表達(dá)EGF蛋白和胞外表達(dá)EGF蛋白較含His標(biāo)簽EGF蛋白對豬的腸上皮細(xì)胞增殖作用更為顯著(P0.05);斷奶仔豬體內(nèi)生物學(xué)活性檢測的結(jié)果所示,胞內(nèi)EGF蛋白、胞外EGF蛋白以及含His標(biāo)簽EGF蛋白也能促進(jìn)小腸發(fā)育(如絨毛高度、隱窩深度、小腸粘膜總蛋白、總DNA及RNA含量)(P0.01),顯著提高其生長性能(如日增重及飼料轉(zhuǎn)化率)(P0.05),降低血液中肌酸激酶及乳酸脫氫酶水平(P0.01),刺激增殖細(xì)胞核抗原陽性細(xì)胞數(shù)量(P0.01),增強(qiáng)其機(jī)體的免疫功能(如Ig A、Ig G及Ig M)等(0.05P0.10);此外,胞內(nèi)表達(dá)EGF蛋白較胞外表達(dá)EGF蛋白及含His標(biāo)簽EGF蛋白能明顯促進(jìn)其小腸發(fā)育,降低血液中肌酸激酶及乳酸脫氫酶水平,提高機(jī)體的免疫功能和生產(chǎn)性能(P0.05);重組酵母能夠存活于斷奶仔豬腸道內(nèi)并能被有效分解利用。(4)根據(jù)DGGE技術(shù)檢測16S r DNA的V3區(qū)菌群結(jié)果,重組酵母組[如,INVSc1-EE(+)、INVSc1-TE(-)及INVSc1-IE(+)]的優(yōu)勢菌群較對照組和空載體組更明顯且趨于穩(wěn)定;重組酵母組較對照組和空載體組顯著提高斷奶仔豬對飼糧養(yǎng)分的表觀消化率(能量、粗蛋白、粗脂肪和粗纖維)(P0.05);進(jìn)一步比較三種不同表達(dá)的EGF蛋白的對飼糧養(yǎng)分消化率及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,胞內(nèi)表達(dá)EGF蛋白組的其養(yǎng)分消化率更高(P0.05)且腸道微生態(tài)環(huán)境中的優(yōu)勢菌群更趨于穩(wěn)定。(5)與對照組和空載體組相比,重組酵母組能顯著提高斷奶仔豬小腸各段(十二指腸、空腸及回腸)粘膜上的CK、LDH、Sucrase及ALP酶的酶活力(P0.05),并顯著提高其CK、LDH、Sucrase、ALP及EGF-R等基因的m RNA表達(dá)水平(P0.05);此外,INVSc1-IE(+)組(胞內(nèi)表達(dá)EGF蛋白)較胞INVSc1-EE(+)組(胞外表達(dá)EGF蛋白)及INVSc1-TE(-)組(含His標(biāo)簽EGF蛋白)也能顯著提高CK、LDH、Sucrase及ALP等酶的酶活力(P0.05)及CK、LDH、Sucrase、ALP和EGF-R基因的m RNA表達(dá)水平(P0.05)。[結(jié)論]本研究成功構(gòu)建的重組釀酒酵母INVSc1-IE(+)、INVSc1-EE(+)及INVSc1-TE(-)表達(dá)的EGF重組蛋白具有高生物學(xué)活性,且表達(dá)量為30mg·L-1。胞內(nèi)表達(dá)EGF蛋白較胞外表達(dá)EGF蛋白及含His標(biāo)簽EGF蛋白在斷奶SD大鼠及仔豬的體內(nèi)外具有更高的生物學(xué)活性,且更適用于畜牧生產(chǎn)及臨床醫(yī)學(xué)。
【學(xué)位授予單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.2

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