發(fā)布時間：2017-11-14 20:41

  本文關(guān)鍵詞：單核細(xì)胞增生李斯特菌ncRNA rli60基因缺失株的構(gòu)建及部分生物學(xué)特性研究

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【摘要】：單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性致病菌,可以引起人和動物流產(chǎn)、腦膜腦炎、敗血癥等癥狀,是一種對公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)危害較大的人獸共患病原菌,被世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)定為四大食源性致病菌之一。該菌廣泛存在于自然環(huán)境中,對低溫、高滲、酸性、堿性、消毒劑等外界環(huán)境具有廣泛適應(yīng)性,這種毒力和應(yīng)激能力與其表達(dá)的毒力因子、環(huán)境應(yīng)激因子以及相關(guān)調(diào)控分子密切相關(guān)。非編碼RNA(nc RNA)作為一種調(diào)控分子可以通過調(diào)節(jié)毒力基因和環(huán)境應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)來影響LM毒力及其環(huán)境應(yīng)激能力。目前,利用生物信息學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)在LM中已經(jīng)鑒定出多種nc RNAs,這些nc RNAs與LM毒力、環(huán)境應(yīng)激、金屬離子轉(zhuǎn)運、生物膜生成、糖代謝、侵染、胞內(nèi)寄生等生命活動密切相關(guān)。Rli60屬于LM nc RNAs中的成員之一,其功能至今尚不清楚。鑒于此,本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建rli60及nc RNA伴侶分子hfq基因缺失株,通過分析缺失株與母源株毒力和環(huán)境應(yīng)激等表型差異并研究Rli60調(diào)控相關(guān)基因相對轉(zhuǎn)錄水平變化,以期揭示Rli60對LM毒力和環(huán)境應(yīng)激的調(diào)控作用。研究方法和主要研究結(jié)果如下:1.LM nc RNA rli60和伴侶分子hfq基因的克隆、分子特征分析及其缺失株的構(gòu)建與鑒定擴增、克隆LM-SB5 rli60及伴侶分子hfq基因并測序,對nc RNA Rli60二級結(jié)構(gòu)、潛在作用靶點及hfq基因的分子特征進行分析。分別擴增rli60及hfq基因上、下游同源臂,采用重疊延伸PCR(SOE-PCR)得到rli60和hfq基因缺失的融合片段△rli60和△hfq,構(gòu)建具有氯霉素抗性的p KSV7-△rli60和p KSV7-△hfq重組穿梭質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)化至LM-SB5感受態(tài)細(xì)胞中,在溫度和氯霉素的雙重選擇壓力下進行同源重組;篩選無氯霉素抗性的基因缺失株,并檢測其遺傳穩(wěn)定性。利用q RT-PCR檢測hfq基因缺失對rli60基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果成功克隆了rli60和hfq基因,分析顯示rli60基因全長246 bp,二級結(jié)構(gòu)呈“X”型莖環(huán)結(jié)構(gòu),包含9個環(huán)狀結(jié)構(gòu)和5段互補的雙鏈結(jié)構(gòu),其潛在作用靶點包括hly、inl F、dlt A、rsb U、glt D、mpl等與毒力及環(huán)境應(yīng)激相關(guān)的基因。hfq基因全長234bp,編碼77個氨基酸,對推導(dǎo)的Hfq氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)從N端到C端包含1個α-螺旋及5個β-折疊,具有RNA結(jié)合位點及六聚體結(jié)合位點,可能在參與LM nc RNAs調(diào)節(jié)基因表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。同時,成功構(gòu)建并篩選得到遺傳性穩(wěn)定的基因缺失株LM-△rli60與LM-△hfq,重組缺失株經(jīng)PCR鑒定得到與缺失后的預(yù)期值1543 bp及1421 bp相符的目的條帶。在LM-△hfq中,rli60基因的相對轉(zhuǎn)錄水平為0.91,與LM-SB5相比其轉(zhuǎn)錄水平并無顯著變化(p0.05),表明Rli60在LM中可能通過不依賴于Hfq蛋白的方式發(fā)揮作用。2.nc RNA rli60基因缺失對LM環(huán)境應(yīng)激及生物膜生成能力的影響為了解rli60基因缺失對LM-SB5環(huán)境應(yīng)激能力及生物膜生成能力的影響,通過檢測LM-SB5與LM-△rli60在不同溫度、p H、高滲及乙醇條件下的環(huán)境應(yīng)激能力及生物膜生成能力,并利用q RT-PCR檢測生物膜生成相關(guān)基因glt B和glt C轉(zhuǎn)錄水平,分析rli60基因缺失對LM環(huán)境應(yīng)激及生物膜生成能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與LM-SB5株相比,LM-△rli60對30℃低溫、42℃高溫、堿性、3.5%乙醇環(huán)境應(yīng)激能力及在48 h的生物膜生成能力顯著減弱(p0.05)。q RT-PCR檢測結(jié)果顯示,LM-△rli60中g(shù)lt B基因的轉(zhuǎn)錄水平在24 h及48 h顯著降低(p0.05),glt C基因的轉(zhuǎn)錄水平在48 h顯著降低(p0.05),推測Rli60通過影響生物膜生成基因glt B、glt C的表達(dá)而導(dǎo)致生物膜生成能力下降。研究結(jié)果表明,nc RNA Rli60對LM環(huán)境應(yīng)激及生物膜生成發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。3.nc RNA rli60基因缺失對LM毒力的影響通過動物感染試驗檢測LM-SB5與LM-△rli60對昆明系小鼠的LD50,肝、脾載菌量及對肝、脾、腎的病理損傷;利用溶血試驗及磷脂酶試驗檢測LM-SB5與LM-△rli60的溶血活性及磷脂酶活性;通過細(xì)胞侵染試驗分析LM-SB5與LM-△rli60對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的黏附力、侵襲力、胞內(nèi)生存增殖能力并利用q RT-PCR檢測毒力基因相對轉(zhuǎn)錄水平,分析rli60基因缺失對LM毒力的影響。結(jié)果顯示,與LM-SB5相比,LM-△rli60對昆明系小鼠的LD50上升了2.12個對數(shù)數(shù)量級,毒力顯著降低(p0.05);肝、脾載菌量顯著下降;對肝、脾、腎的病理損傷也有所減弱。LM-△rli60較LM-SB5溶血能力下降了4倍;二者均具有一定磷脂酶活性。LM-△rli60對細(xì)胞黏附力顯著升高,侵襲力及胞內(nèi)的生存增殖能力顯著降低(p0.05);毒力基因相對轉(zhuǎn)錄水平也發(fā)生顯著變化,其中prf A、inl A、inl B基因在LM-△rli60中相對轉(zhuǎn)錄水平升高,plc A、hly、act A基因在LM-△rli60中相對轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(p0.05)。研究結(jié)果表明,nc RNA Rli60對LM毒力發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本研究通過同源重組方法構(gòu)建了rli60基因缺失株LM-△rli60,并研究了rli60基因缺失對其環(huán)境應(yīng)激能力和毒力的影響。與LM-SB5相比,LM-△rli60對低溫、高溫、堿性及乙醇環(huán)境應(yīng)激能力顯著降低,對小鼠毒力、細(xì)胞侵襲力、胞內(nèi)生存增殖能力及溶血能力顯著降低,證實Rli60對LM環(huán)境應(yīng)激能力及毒力具有重要的調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

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本文編號：1186906