本文關(guān)鍵詞：VPg蛋白在兔出血癥病毒翻譯起始過程中的作用研究

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【摘要】：兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種急性、致死性傳染病。深入開展該病原的基礎(chǔ)研究,可以為RHD的綜合防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。由于兔出血癥病毒缺乏在體外增殖培養(yǎng)的細胞系,嚴重阻礙了其分子生物學的基礎(chǔ)研究。VPg蛋白為RHDV的非結(jié)構(gòu)蛋白,與病毒基因組RNA 5′-末端共價相連。近年來,在杯狀病毒科其它成員的研究中發(fā)現(xiàn),VPg蛋白在諾瓦克病毒和貓杯狀病毒的翻譯和復制中發(fā)揮重要作用。但VPg蛋白在RHDV生命過程中的功能還不清楚。鑒于此,本研究利用蛋白質(zhì)互作、RNA干擾及反向遺傳學等技術(shù)研究VPg蛋白在RHDV翻譯起始過程中的功能;此外,為了克服體外增殖培養(yǎng)的瓶頸,我們還利用反向遺傳學技術(shù),人工構(gòu)建了可在兔源細胞中穩(wěn)定增殖的RHDV突變體,為深入研究VPg蛋白的生物學功能及病毒的致病機制和疫苗等提供了良好的平臺。本論文研究內(nèi)容主要包括以下3個方面:(1)構(gòu)建了pLOV-3Flag-VPg重組質(zhì)粒,然后利用慢病毒包裝系統(tǒng),成功獲得了穩(wěn)定表達RHDV VPg蛋白的細胞系,并命名為RK-VPg細胞。經(jīng)過PCR、RT-PCR和Western blot實驗的鑒定,結(jié)果表明RK-VPg細胞系能穩(wěn)定高效的表達VPg蛋白。RK-VPg細胞系為研究VPg蛋白在RHDV生命周期中的作用提供了良好的平臺。(2)通過定點突變RHDV衣殼蛋白表面高度變異區(qū)(V1)的第305位和第307位氨基酸,構(gòu)建了含突變位點RGD的RHDV基因組全長重組質(zhì)粒pRHDVRGD。然后,將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RK-13細胞中,盲傳三代后出現(xiàn)典型細胞病變。IFA、Western blot、RT-PCR和透射電子顯微鏡檢測結(jié)果均證明成功拯救出RHDVRGD突變株。該人工構(gòu)建RHDV不僅能夠在RK-13細胞中穩(wěn)定增殖傳代,而且繼承了母本毒株的生物學特性。將收獲的第35代RHDVRGD接種試驗兔,在48~72h內(nèi),動物死亡,表現(xiàn)出典型兔瘟癥狀。將RHDVRGD細胞培養(yǎng)物滅活后免疫試驗兔可以抵抗野毒的侵襲�？傊�,本研究人工構(gòu)建的RHDVRGD繼承了母本毒株的生物學特性,具有良好免疫原性,為研究兔瘟病毒的致病機理、分子生物學以及研發(fā)RHDV細胞滅活疫苗奠定了基礎(chǔ)。(3)利用反向遺傳學技術(shù),構(gòu)建了缺失VPg基因的RHDV復制子(pRHDV-luc/?VPg)和感染性克隆(pRHDVRGD-?VPg),在細胞水平證明了VPg是RHDV翻譯所必需的蛋白;分別利用哺乳動物雙雜交、免疫共沉淀和雙分子熒光互補等技術(shù)在體外證明RHDV VPg蛋白可與真核細胞翻譯起始因子eIF4E相互作用,從而揭示了VPg在RHDV基因組翻譯起始過程中發(fā)揮作用的分子基礎(chǔ),即VPg蛋白在RHDV基因組翻譯起始階段充當帽子類似物的功能。綜上所述,本論文分別構(gòu)建了穩(wěn)定表達RHDV VPg蛋白的細胞系和能在兔源細胞系中穩(wěn)定增殖的RHDVRGD。在此基礎(chǔ)上,首次證明VPg是RHDV翻譯所需要的蛋白,其發(fā)揮作用的分子基礎(chǔ)在于它能夠與eIF4E相互作用,發(fā)揮帽子類似物的功能。上述研究成果不僅解決了長期以來兔瘟病毒不能夠用細胞培養(yǎng)的難題,而且為深入研究兔瘟病毒的翻譯、復制和細胞疫苗等奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：兔出血癥病毒 VPg蛋白 eIF4E 反向遺傳學
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-14
• 英文縮略表14-15
• 第一章 引言15-24
• 1.1 兔出血癥病毒概述15-16
• 1.2 杯狀病毒與宿主相互作用研究進展16-19
• 1.2.1 杯狀病毒概述16-17
• 1.2.2 杯狀病毒受體17-19
• 1.3 病毒與宿主相互作用研究技術(shù)19-23
• 1.3.1 雙雜交系統(tǒng)19-20
• 1.3.2 免疫共沉淀（Co-IP）20
• 1.3.3 串聯(lián)親和純化技術(shù)20-21
• 1.3.4 GST-Pulldown技術(shù)21-22
• 1.3.5 雙分子熒光互補技術(shù)（BiFC）22
• 1.3.6 其他蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)22-23
• 1.4 本研究的目的及意義23-24
• 第二章 穩(wěn)定表達RHDV VPg蛋白RK-13細胞系的構(gòu)建24-34
• 2.1 材料25-26
• 2.1.1 質(zhì)粒、細胞系和菌種25
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備25
• 2.1.3 主要試劑及抗體25
• 2.1.4 主要緩沖液及試劑的配制25-26
• 2.2 研究方法26-30
• 2.2.1 慢病毒包裝質(zhì)粒pLOV-3Flag-VPg的構(gòu)建26-27
• 2.2.2 制備含VPg基因的重組慢病毒樣顆粒27
• 2.2.3 表達VPg基因的RK-13細胞系的制備及陽性細胞株的篩選27-28
• 2.2.4 VPg基因組插入水平檢測以及mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測28-29
• 2.2.5 VPg蛋白表達水平Western blot檢測以及間接免疫熒光（IFA）檢測29-30
• 2.3 結(jié)果30-33
• 2.3.1 p LOV-3Flag-VPg重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定30-31
• 2.3.2 穩(wěn)定表達VPg的RK-13細胞篩選31
• 2.3.3 細胞基因組中外源基因以及其轉(zhuǎn)錄mRNA的檢測31
• 2.3.4 Western blot檢測和間接免疫熒光（IFA）分析外源基因蛋白表達31-33
• 2.4 討論33-34
• 第三章 人工構(gòu)建能在細胞中增殖的兔出血癥病毒34-46
• 3.1 材料35-36
• 3.1.1 質(zhì)粒和細胞系35
• 3.1.2 主要儀器設(shè)備、試劑及抗體35-36
• 3.1.3 主要緩沖液及試劑的配制36
• 3.2 方法36-38
• 3.2.1 構(gòu)建含RHDVRGD突變株全基因的pRHDVRGD重組質(zhì)粒36
• 3.2.2 RHDVRGD突變株的拯救36-37
• 3.2.3 RT-PCR鑒定RHDVRGD突變株37
• 3.2.4 間接免疫熒光IFA鑒定RHDVRGD突變株37
• 3.2.5 Western blot鑒定RHDVRGD突變株37
• 3.2.6 RHDVRGD突變株負染透射電鏡觀察37
• 3.2.7 RHDVRGD突變株動物回歸實驗37-38
• 3.2.8 RHDVRGD突變株免疫保護實驗38
• 3.3 結(jié)果38-44
• 3.3.1 pRHDVRGD重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定38-39
• 3.3.2 RHDVRGD病毒突變株拯救觀察結(jié)果39-40
• 3.3.3 RHDVRGD病毒突變株RT-PCR鑒定40-41
• 3.3.4 RHDVRGD病毒突變株IFA鑒定41
• 3.3.5 RHDVRGD病毒突變株Western blot鑒定41-42
• 3.3.6 病毒突變株RHDVRGD透射電鏡觀察42
• 3.3.7 RHDVRGD突變株動物回歸實驗結(jié)果42-44
• 3.3.8 RHDVRGD突變株免疫保護實驗結(jié)果44
• 3.4 討論44-46
• 第四章 VPg在兔出血癥病毒翻譯起始階段的功能研究46-65
• 4.1 材料和方法47-56
• 4.1.1 病毒cDNA與細胞系47
• 4.1.2 抗體與質(zhì)粒47
• 4.1.3 主要試劑與儀器47
• 4.1.4 主要緩沖液及試劑的配制47
• 4.1.5 質(zhì)粒構(gòu)建47-48
• 4.1.6 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染方法48-49
• 4.1.7 熒光素酶活性檢測49-50
• 4.1.8 qRT-PCR分析50-51
• 4.1.9 哺乳動物雙雜交實驗51
• 4.1.10 免疫共沉淀（Co-IP）實驗51
• 4.1.11 雙分子熒光互補（BiFC）實驗51-52
• 4.1.12 siRNA干擾eIF4E功能實驗52-53
• 4.1.13 4EBP1影響RHDV翻譯實驗53
• 4.1.14 RNA電泳遷移率變動分析(REMSA) 實驗53-56
• 4.1.15 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析56
• 4.2 結(jié)果56-64
• 4.2.1 VPg與RHDV基因組RNA 5′-末端序列相互作用56-57
• 4.2.2 VPg蛋白為RHDV的翻譯所必需57-59
• 4.2.3 RHDV的VPg蛋白與翻譯起始因子e IF4E相互作用59-62
• 4.2.4 VPg-eIF4E相互作用為RHDV翻譯所必需62-63
• 4.2.5 干擾eIF4E基因?qū)HDV翻譯的影響63-64
• 4.3 討論64-65
• 第五章 全文結(jié)論65-66
• 參考文獻66-76
• 致謝76-77
• 作者簡歷77

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7 周q，

本文編號：1100166