本文關(guān)鍵詞：對(duì)蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26與細(xì)胞穿膜肽的融合蛋白在畢赤酵母中的組成型表達(dá)研究

  更多相關(guān)文章： 白斑綜合征病毒 細(xì)胞穿膜肽 VP28 VP26 分泌表達(dá) 畢赤酵母

【摘要】：白斑綜合征病毒(WSSV)是危害全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的病原體之一,給對(duì)蝦養(yǎng)殖帶來了巨大危害。雖然目前還沒有有效地控制該病毒蔓延的方法,但是隨著wssv基因組測(cè)序的完成,該病毒結(jié)構(gòu)基因的組成與功能越來越清晰,這為研究病毒侵染對(duì)蝦細(xì)胞的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。在研究病毒侵染對(duì)蝦機(jī)制的過程中,研究者們發(fā)現(xiàn)病毒的某些囊膜蛋白在啟動(dòng)病毒感染的發(fā)生或介導(dǎo)病毒的侵入方面起著重要作用,其中VP28和VP26就是兩種非常重要的病毒囊膜蛋白。越來越多的研究表明將一些重要的病毒囊膜蛋白導(dǎo)入對(duì)蝦體內(nèi)后,能夠增強(qiáng)對(duì)蝦抗WSSV侵染的能力,而這一研究結(jié)果促進(jìn)了wssv蛋白質(zhì)亞單位疫苗的誕生。然而蛋白亞單位疫苗的本質(zhì)是蛋白質(zhì),在通過口服的方式免疫對(duì)蝦時(shí),由于無法以蛋白質(zhì)大分子的形式被吸收,而達(dá)不到很好的免疫效果,因此需要尋求能夠攜帶大分子貨物穿越細(xì)胞膜的載體—細(xì)胞穿膜肽(CPPs)的幫助。本研究首先利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了CPPs-GFP的融合蛋白,所選用的CPPs分別是TAT、R9和Penetratin,并證明CPPs可以攜帶蛋白質(zhì)GFP(綠色熒光蛋白)活體穿過克氏原螯蝦的腸系膜進(jìn)入到蝦體的血液循環(huán)中,然后到達(dá)各個(gè)組織。在此基礎(chǔ)上,再次利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功分泌性表達(dá)了VP28和VP26與CPPs的融合蛋白,為WSSV蛋白質(zhì)亞單位疫苗規(guī)�；a(chǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：1.TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP融合蛋白在畢赤酵母中成功分泌性表達(dá)。首先,提取pTracer-CMV2質(zhì)粒作為擴(kuò)增GFP基因的模板,并且根據(jù)TAT、 R9和Penetratin的氨基酸序列利用Codon Adaptation Tool軟件設(shè)計(jì)了適合在酵母中表達(dá)的核酸序列,通過引物懸掛法將這些核酸序列添加到了GFP基因的5’端。選擇表達(dá)載體pGAPZαA的EcoRI和XbaⅠ雙限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),因此在目的基因的兩端也分別添加了EcoRⅠ和XbaⅠ的核酸序列。然后,將酶切后的目的基因插入到表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)博萊霉素(Zeocin)抗性篩選陽性克隆,通過測(cè)序后可知重組表達(dá)載體成功構(gòu)建。其次,重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BlnⅠ (AvrⅡ)酶切線性化之后,電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)Zeocin抗性篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。最后,SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)重組酵母表達(dá)上清目的蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果表明本研究成功利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP蛋白,分子量大小約在29kDa。2.檢測(cè)CPPs攜帶蛋白質(zhì)分子穿膜的效果。實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模發(fā)酵獲得GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP目的蛋白,經(jīng)冷凍干燥后獲得蛋白上清冷凍干粉,接著用PBS配制成10mg/ml的蛋白母液。用克氏原螯蝦作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,活體灌喂等體積等濃度的GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液,同時(shí)灌喂等體積的PBS作為陰性對(duì)照。灌喂兩小時(shí)后分別取樣鰲蝦的中腸、心臟和肌肉組織進(jìn)行冷凍切片分析,利用熒光倒置顯微鏡可以觀察到,灌喂TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液組的鰲蝦的腸道、心臟和肌肉可以看到明顯的熒光,而灌喂GFP蛋白液的鰲蝦僅在腸道中看到微弱的熒光,陰性對(duì)照沒有觀察到任何熒光。3.VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9融合蛋白在畢赤酵母中組成型分泌表達(dá)。根據(jù)Genbank中WSSV的基因序列設(shè)計(jì)引物,以WSSV粗提液為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,得到VP28和VP26基因。同樣用引物懸掛法將TAT和R9的核酸序列添加到VP28、VP26和GFP基因的3’端,并且添加EcoRI和XbaI酶切位點(diǎn)。目的基因經(jīng)過雙酶切、與表達(dá)載體連接、線性化、轉(zhuǎn)化畢赤酵母和篩選重組酵母這一系列分子克隆操作過程后,成功得到了重組酵母。SDS-PAGE電泳分析畢赤酵母表達(dá)上清的目的蛋白,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色發(fā)現(xiàn)GFP-TAT和GFP-R9表達(dá)上清有明顯條帶,蛋白分子量大小在29kDa左右,但是沒有檢測(cè)到VP28-TAT/R9和VP26-TAT/R9重組蛋白的存在。隨后,采用更靈敏的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法—蛋白質(zhì)銀染法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)VP28-TAT/R9和VP26-TAT/R9表達(dá)上清組有明顯的條帶,證明VP28和VP26及其與TAT和R9的融合蛋白在畢赤酵母中成功表達(dá),蛋白分子量大小約為32kDa。
【關(guān)鍵詞】：白斑綜合征病毒 細(xì)胞穿膜肽 VP28 VP26 分泌表達(dá) 畢赤酵母
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S945.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 引言15-17
• 第一章 文獻(xiàn)綜述17-28
• 第一節(jié) WSSV疫苗研究進(jìn)展17-22
• 1 前言17-18
• 2 對(duì)蝦白斑綜合征病毒的結(jié)構(gòu)蛋白18-19
• 3 DNA疫苗19-20
• 4 蛋白質(zhì)亞單位疫苗20-21
• 5 總結(jié)21-22
• 第二節(jié) 細(xì)胞穿膜肽的研究進(jìn)展22-26
• 1 前言22-23
• 2 細(xì)胞穿膜肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)23-24
• 3 細(xì)胞穿膜肽的穿膜機(jī)制24-26
• 4 細(xì)胞穿膜肽的應(yīng)用26
• 第三節(jié) 本實(shí)驗(yàn)的研究目的和意義26-28
• 1 研究目的26-27
• 2 研究意義27-28
• 第二章 克氏原螯蝦口服畢赤酵母表達(dá)的三種穿膜肽與GFP的融合蛋白穿腸膜效果的比較28-65
• 第一節(jié) 表達(dá)載體的構(gòu)建29-45
• 1 材料和方法29-39
• 1.1 材料29-31
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器29
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑29-31
• 1.1.3 引物設(shè)計(jì)31
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法31-39
• 1.2.1 GFP基因的克隆31-33
• 1.2.2 TAT-GFP、R9-GFP和Pentratin-GFP目的片段的獲得33-35
• 1.2.3 目的基因的連接及轉(zhuǎn)化35-36
• 1.2.4 目的基因俊落PCR鑒定及測(cè)序36-37
• 1.2.5 CPPs-GFP質(zhì)粒和pGAPZaA表達(dá)質(zhì)粒的提取37
• 1.2.6 質(zhì)粒DNA的雙酶切及切膠回收37-38
• 1.2.7 pGAPZaA-目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建38
• 1.2.8 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top1038
• 1.2.9 重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定38-39
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-44
• 2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增39-42
• 2.1.1 GFP基因的獲得39-40
• 2.1.2 TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP基因的獲得40-41
• 2.1.3 目的基因菌落PCR鑒定41-42
• 2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建與PCR鑒定42-44
• 2.2.1 目的基因質(zhì)粒雙酶切結(jié)果42
• 2.2.2 重組質(zhì)粒PCR鑒定42-44
• 2.2.3 重組質(zhì)粒DNA測(cè)序44
• 3 小結(jié)44-45
• 第二節(jié) 目的基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及穿膜效果初步研究45-65
• 1 材料與方法45-55
• 1.1 材料45-47
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物45
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器45
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑45-47
• 1.1.4 引物設(shè)計(jì)47
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法47-55
• 1.2.1 重組質(zhì)粒的大量提取47-48
• 1.2.2 重組質(zhì)粒Bln Ⅰ酶切線性化48-49
• 1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母49-51
• 1.2.4 重組畢赤酵母PCR鑒定51-53
• 1.2.5 重組酵母表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)53-54
• 1.2.6 冷凍干燥目的蛋白54-55
• 1.2.7 重組蛋白體內(nèi)腸道穿膜觀察55
• 2 結(jié)果55-59
• 2.1 重組質(zhì)粒在畢赤酵母分泌表達(dá)結(jié)果55-58
• 2.1.1 重組質(zhì)粒Bln Ⅰ酶切線性化55-56
• 2.1.2 重組酵母PCR鑒定56-57
• 2.1.3 重組酵母發(fā)酵上清SDS-PAGE電泳結(jié)果57-58
• 2.2 細(xì)胞穿膜肽攜帶GFP穿膜效果58-59
• 2.2.1 GFP腸道穿膜觀察58-59
• 2.2.2 GFP心臟和肌肉穿膜結(jié)果59
• 3 小結(jié)與討論59-65
• 3.1 小結(jié)59-60
• 3.2 討論60-65
• 3.2.1 畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化60
• 3.2.2 重組酵母PCR鑒定60-65
• 第三章 WSSV囊膜蛋白VP28、VP26與穿膜肽的融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)65-83
• 第一節(jié) VP28和VP26表達(dá)載體的構(gòu)建65-75
• 1 材料與方法65-70
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料65-66
• 1.1.1 主要儀器65
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑65
• 1.1.3 引物65-66
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法66-70
• 1.2.1 VP28和VP26基因的獲得66-67
• 1.2.2 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9目的片段的擴(kuò)增67-69
• 1.2.3 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9基因的連接及轉(zhuǎn)化69-70
• 1.2.4 菌落PCR鑒定及測(cè)序70
• 1.2.5 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9質(zhì)粒提取70
• 1.2.6 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建70
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果70-74
• 2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增70-73
• 2.1.1 VP28、VP26和GFP基因的獲得70-71
• 2.1.2 VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9基因的獲得71-72
• 2.1.3 菌落PCR鑒定72-73
• 2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及菌落PCR鑒定73-74
• 3 小結(jié)與討論74-75
• 3.1 小結(jié)74
• 3.2 討論74-75
• 第二節(jié) VP28和VP26在畢赤酵母中分泌表達(dá)75-83
• 1 材料與方法75-77
• 1.1 材料75-76
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑75-76
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器76
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法76-77
• 1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒大量提取76
• 1.2.2 表達(dá)質(zhì)粒線性化76
• 1.2.3 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母及PCR檢測(cè)76
• 1.2.4 重組酵母表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)76-77
• 2 結(jié)果77-81
• 2.1 重組酵母PCR檢測(cè)結(jié)果77-81
• 2.1.1 重組質(zhì)粒線性化77-78
• 2.1.2 重組酵母PCR鑒定結(jié)果78-79
• 2.1.3 重組酵母發(fā)酵上清SDS-PAGE電泳結(jié)果79-81
• 3 小結(jié)與討論81-83
• 3.1 小結(jié)81
• 3.2 討論81-83
• 第四章 全文總結(jié)與展望83-84
• 1 全文總結(jié)83
• 2 展望83-84
• 參考文獻(xiàn)84-91
• 致謝91-92
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷92
• 已發(fā)表和擬發(fā)表的論文92

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8 ;吉大抗腫瘤生物工程新藥進(jìn)入臨床試驗(yàn)[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2005年

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10 曹麗君;英研制出新型抗流感藥物[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

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2 吳芩;Npu DnaE intein的結(jié)構(gòu)與機(jī)理研究和蛋白質(zhì)雙模式成像探針的制備及應(yīng)用[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

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4 侯s，

本文編號(hào)：1099208