本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子ZmNAM056調(diào)控玉米淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)的初探

  更多相關(guān)文章： 玉米淀粉 關(guān)鍵基因 ZmNAM056轉(zhuǎn)錄因子 表達(dá)模式 瞬時(shí)表達(dá) 酵母單雜交

【摘要】：玉米(Zea may L.)是世界第一大糧食作物,種植面積和產(chǎn)量均居三大糧食作物之首,玉米淀粉也是各種植物淀粉中化學(xué)成分最佳的淀粉之一。如今,隨著世界人口的日益增加,資源及耕地面積的日益減少,對(duì)作物產(chǎn)量及品質(zhì)的要求也就越來(lái)越高。淀粉的生物合成過程的核心包括ADPG的合成,多糖鏈的延伸,多糖鏈的的分支,多糖鏈的去分支。淀粉的生物合成是一個(gè)十分復(fù)雜的過程,是在一系列酶的共同催化下完成的,在籽粒胚乳中淀粉合成的最后階段涉及四類非常關(guān)鍵的酶類：腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase, AGPase)、淀粉合成酶(Starch synthase, SS)、淀粉分支酶(Starch branching enzyme, SBE)和淀粉去分支酶(Starch debranching enzyme, DBE)。目前對(duì)于淀粉相關(guān)合成酶的功能研究做得相對(duì)成熟,但對(duì)于淀粉合成相關(guān)酶的上游調(diào)控機(jī)制研究,即淀粉合成相關(guān)酶的順式作用元件和反式作用因子的研究報(bào)道較少。我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和現(xiàn)有基因資源選取在玉米胚乳中特異表達(dá)或高表達(dá)的參與淀粉合成關(guān)鍵酶編碼的8個(gè)基因：Sh2、Bt2、SSⅠ、SSⅡa, SSⅢa、sbel、sbeⅡb、 Isal。課題組前期通過RNA-seq測(cè)定玉米籽粒灌漿時(shí)期不同關(guān)鍵點(diǎn)胚乳RNA表達(dá)譜,篩選了可能參與玉米胚乳淀粉合成的轉(zhuǎn)錄因子；同時(shí)利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)通過共相關(guān)分析、篩選與上述8個(gè)淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,取相關(guān)系數(shù)極高的轉(zhuǎn)錄因子列為候選轉(zhuǎn)錄因子。我們比較通過這兩種方法篩選到的候選轉(zhuǎn)錄因子,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)共同的NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子,并命名為ZmNAM056。在此基礎(chǔ)之上采用半定量RT-PCR或熒光定量PCR、基因瞬時(shí)表達(dá)、酵母單雜交以及亞細(xì)胞定位繼續(xù)驗(yàn)證篩選的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的調(diào)控作用,具體結(jié)果如下：1以玉米優(yōu)良骨干自交系B73為實(shí)驗(yàn)材料,我們成功從玉米胚乳中克隆到該轉(zhuǎn)錄因子,該基因含有一個(gè)編碼391個(gè)氨基酸的開放閱讀框。其他植物氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì),發(fā)現(xiàn)ZmNAM056轉(zhuǎn)錄因子含有NAC轉(zhuǎn)錄因子特有的N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。2對(duì)ZmNAM056基因表達(dá)模式進(jìn)行了分析。半定量PCR結(jié)果表明ZmNAM056基因在籽粒中特異表達(dá)；隨后實(shí)時(shí)熒光定量PCR,結(jié)果表明ZmNAM056基因在授粉后前7天的籽粒中表達(dá)量較低,授粉后10天開始大量表達(dá),授粉后20天達(dá)到最高,并且發(fā)現(xiàn)同玉米胚乳淀粉合成相關(guān)基因表現(xiàn)出極強(qiáng)的正相關(guān)。同時(shí)還研究了不同糖類和植物激素對(duì)胚乳淀粉合成相關(guān)基因及ZmNAM056基因表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中AGPase基因Brittle-2、Shrunken-2在所處理?xiàng)l件下其表達(dá)趨勢(shì)是一致的,都受Glu、Suc、ABA的誘導(dǎo),Fru、Tre的抑制；淀粉合成酶類(SSs)基因,SSⅡa受Glu的顯著誘導(dǎo),卻不受ABA的誘導(dǎo),SSⅢa受ABA的顯著誘導(dǎo),卻不受Glu的誘導(dǎo),SSI受Glu跟ABA的顯著誘導(dǎo)；淀粉合成分支酶類(SBE)基因BEI受Tre、Suc的顯著誘導(dǎo),而SBEⅡb受Fru、Glu的顯著誘導(dǎo)。這些結(jié)果說明同一個(gè)基因在不同處理?xiàng)l件下,其表達(dá)是有很大差異的,不同基因在相同條件處理時(shí),有些基因的表達(dá)趨勢(shì)是一致的,而有些表達(dá)趨勢(shì)又是有差異的。其中蔗糖、葡萄糖、ABA對(duì)這些基因的表達(dá)影響較大。ZmNAM056基因的表達(dá)卻不受蔗糖的影響；激素ABA跟葡萄糖促進(jìn)ZmNAM056基因的表達(dá),有趣的是蔗糖跟ABA協(xié)同處理時(shí),促進(jìn)效果更明顯。3構(gòu)建35S::ZmNAM-GFP融合蛋白表達(dá)載體,通過基因槍轟擊介導(dǎo)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞定位,結(jié)果表明ZmNAM056編碼蛋白定位于細(xì)胞核中；通過酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分析表明,ZmNAM056基因編碼蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活性。同時(shí)克隆玉米ZmNAM056蛋白的編碼序列連接入pET-28載體,在大腸桿菌RosettaTM(DE3)菌株中進(jìn)行原核表達(dá),然后通過Ni-Agarose柱純化6×His-ZmNAM056融合蛋白。4通過基因槍轟擊介導(dǎo)玉米胚乳的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)以及酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子ZmNAM056同淀粉合成相關(guān)基因啟動(dòng)子的結(jié)合作用情況,發(fā)現(xiàn)ZmNAM056上調(diào)Sh2、Bt2基因的表達(dá)很有可能是通過間接的作用調(diào)控的；對(duì)SSⅡa、sbellb基因的上調(diào)和對(duì)sbe1基因的抑制是通過直接與其啟動(dòng)子結(jié)合從而調(diào)控其基因的轉(zhuǎn)錄。
【關(guān)鍵詞】：玉米淀粉 關(guān)鍵基因 ZmNAM056轉(zhuǎn)錄因子 表達(dá)模式 瞬時(shí)表達(dá) 酵母單雜交
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S513
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 縮寫表9-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-22
• 1.1 淀粉的結(jié)構(gòu)和基本性質(zhì)13
• 1.2 淀粉的生物合成13-14
• 1.3 淀粉合成關(guān)鍵酶14-18
• 1.3.1 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)14-15
• 1.3.2 淀粉合成酶(SS)15-16
• 1.3.3 淀粉分支酶(SBE)16-17
• 1.3.4 淀粉去分支酶(DBE)17
• 1.3.5 淀粉磷酸化酶(SP)17-18
• 1.4 淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控18-21
• 1.4.1 時(shí)空表達(dá)的調(diào)控18-19
• 1.4.2 糖與激素誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控19-20
• 1.4.3 淀粉合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究進(jìn)展20-21
• 1.5 研究目的和意義21-22
• 1.6 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線22
• 2. 材料和方法22-41
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 2.1.1 植物材料22
• 2.1.2 質(zhì)粒載體及菌種22-23
• 2.1.3 主要試劑和試劑盒23
• 2.1.4 主要溶液23-24
• 2.1.5 主要培養(yǎng)基24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-41
• 2.2.1 半定量RT-PCR24-27
• 2.2.2 ZmNAM056基因的克隆27
• 2.2.3 不同時(shí)期胚乳淀粉積累和熒光定量PCR27-28
• 2.2.4 淀粉合成關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子的克隆及活性驗(yàn)證28-33
• 2.2.5 轉(zhuǎn)錄因子ZmNAM056與淀粉合成酶關(guān)鍵基因啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)33-35
• 2.2.6 酵母單雜交35-37
• 2.2.7 目的基因的亞細(xì)胞定位37-38
• 2.2.8 目的基因的酵母激活驗(yàn)證38
• 2.2.9 糖與激素對(duì)淀粉合成關(guān)鍵基因ZmNAM056基因的表達(dá)影響38-39
• 2.2.10 原核表達(dá)39-41
• 3 結(jié)果與分析41-57
• 3.1 目的基因半定量RT-PCR表達(dá)分析41-43
• 3.2 ZmNAM056基因的克隆43-45
• 3.3 不同時(shí)期胚乳淀粉積累結(jié)果45-46
• 3.4 不同胚乳時(shí)期淀粉合成關(guān)鍵基因及ZmNAM056基因相對(duì)定量表達(dá)46-49
• 3.5 淀粉合成關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子活性驗(yàn)證49
• 3.6 胚乳中過表達(dá)ZmNAM056基因?qū)﹃P(guān)鍵基因啟動(dòng)子活性的影響49-50
• 3.7 酵母單雜交50-52
• 3.8 ZmNAM056基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位52-53
• 3.9 ZmNAM056基因編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性分析53
• 3.10 各基因在不同處理下的熒光定量PCR結(jié)果53-55
• 3.11 ZmNAM056基因編碼蛋白的原核表達(dá)55-56
• 3.12 ZmNAM056基因原核表達(dá)蛋白的WB檢測(cè)56-57
• 4 討論57-63
• 4.1 玉米淀粉合成關(guān)鍵基因的表達(dá)分析57-58
• 4.2 ZmNAM056基因的功能域表達(dá)分析58-60
• 4.3 ZmNAM056基因調(diào)控玉米淀粉合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄60-61
• 4.4 后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究思路61-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67

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