發(fā)布時(shí)間：2017-10-10 18:25

  本文關(guān)鍵詞：MEN1基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： MEN1 過表達(dá) 限量表達(dá) pcDNA3.1-Myc-His-bmen1 siRNA 細(xì)胞增殖

【摘要】：奶牛的產(chǎn)奶量主要取決于乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量及其分泌活性,增加乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量對(duì)提高產(chǎn)奶量具有重要意義。MEN1編碼menin蛋白,在細(xì)胞增殖分裂、細(xì)胞周期調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、基因組穩(wěn)定等過程中發(fā)揮重要作用。MEN1基因是多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤1型綜合征的關(guān)鍵致病基因之一,對(duì)于特定組織中細(xì)胞的異常增殖起到了誘發(fā)的作用。另一方面,MEN1對(duì)于機(jī)體的正常代謝起著重要的調(diào)控作用。乳腺是一個(gè)重要的代謝器官。本研究擬探討menin在奶牛的乳腺組織及其乳腺上皮細(xì)胞中的功能。研究發(fā)現(xiàn)不同生理階段的奶牛乳腺組織中MEN1/menin表達(dá)存在表達(dá)變化,進(jìn)而通過過表達(dá)/RNAi干擾技術(shù),發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中MEN1/menin表達(dá)變化可以改變細(xì)胞的生長和增殖。主要研究結(jié)果如下：1.利用RT-PCR、WB、免疫組化方法分別檢測不同泌乳階段的奶牛乳腺組織MEN1/Menin的表達(dá)變化。menin蛋白陽性點(diǎn)主要位于乳腺腺泡及乳腺導(dǎo)管的上皮細(xì)胞中,不同生理階段的奶牛乳腺組織中MEN1 mRNA水平存在表達(dá)變化,menin蛋白各組之間無差異。2.成功建立了真核細(xì)胞奶牛Menin蛋白過表達(dá)轉(zhuǎn)染體系。利用基因重組技術(shù),成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Myc-His-bmenl;將重組載體分別轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、小鼠成肌細(xì)胞(C2C12),分別在24h、48h、72h檢測目的基因/蛋白的表達(dá),結(jié)果表明在3種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染24h后過表達(dá)效果最好,在MAC-T、CHO、C2C12細(xì)胞中menin過表達(dá)效率分別達(dá)到4.41、5.65、1.93倍。3.將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MAC-T細(xì)胞,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組MEN1基因表達(dá)顯著升高(P0.01),在轉(zhuǎn)染后24h表達(dá)量最高,轉(zhuǎn)染組是對(duì)照組的27.5倍,menin蛋白的過表達(dá)倍數(shù)為4.41倍。4.成功建立了真核細(xì)胞奶牛Menin蛋白限量表達(dá)體系。將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)MAC-T細(xì)胞中,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染sibMEN-1/2/324h后,MEN1基因在mRNA和蛋白表達(dá)水平相比對(duì)照組均最低并達(dá)到極顯著(P0.01),干擾效率分別為75%、71%。5.在過量/限量表達(dá)menin的條件下,利用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)和qRT-PCR技術(shù),從不同角度都證明menin可以調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞周期。menin過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期沒有顯著影響；menin限量表達(dá)能顯著提高G1期細(xì)胞百分比,降低S期百分比(P0.05),CyclinD3、CyclinB2、CDK6基因的表達(dá)顯著升高,CyclinD1的表達(dá)顯著降低(P0.05)。
【關(guān)鍵詞】：MEN1 過表達(dá) 限量表達(dá) pcDNA3.1-Myc-His-bmen1 siRNA 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 英文縮略詞5-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-21
• 1.1 乳腺13-14
• 1.1.1 乳腺的結(jié)構(gòu)和功能13
• 1.1.2 乳腺的發(fā)育和泌乳過程13
• 1.1.3 泌乳周期內(nèi)乳腺細(xì)胞的增殖和凋亡13-14
• 1.2 細(xì)胞周期14-17
• 1.2.1 細(xì)胞周期時(shí)順調(diào)控機(jī)制14-17
• 1.2.2 細(xì)胞周期監(jiān)控機(jī)制17
• 1.3 MEN1基因研究進(jìn)展17-21
• 1.3.1 MEN1基因概述17-18
• 1.3.2 Menin與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)18
• 1.3.3 Menin與基因組穩(wěn)定18-19
• 1.3.4 Menin與細(xì)胞增殖19-20
• 1.3.5 Menin與細(xì)胞凋亡20
• 1.3.6 Menin與細(xì)胞周期20-21
• 1.4 Menin與乳腺21
• 1.5 本研究的目的意義21
• 2 材料與方法21-38
• 2.1 試驗(yàn)材料21-23
• 2.1.1 奶牛乳腺組織21-22
• 2.1.2 主要儀器22
• 2.1.3 主要試劑及來源22-23
• 2.1.4 常用試劑的配制23
• 2.2 試驗(yàn)方法23-38
• 2.2.1 奶牛MEN1基因過表達(dá)載體的構(gòu)建23-27
• 2.2.2 siRNA的構(gòu)建27
• 2.2.3 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取27-28
• 2.2.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的培養(yǎng)28-29
• 2.2.5 中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)培養(yǎng)29
• 2.2.6 小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)培養(yǎng)29
• 2.2.7 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生物學(xué)性狀檢測29-30
• 2.2.8 轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞系30
• 2.2.9 轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)30-31
• 2.2.10 轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)31
• 2.2.11 組織/細(xì)胞總RNA提取與檢測31-33
• 2.2.12 熒光定量PCR33-35
• 2.2.13 Western blot35-37
• 2.2.14 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖37
• 2.2.15 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期37-38
• 2.3 統(tǒng)計(jì)分析38
• 3 結(jié)果38-58
• 3.1 不同泌乳階段奶牛乳腺組織MEN1/menin的表達(dá)分析38-40
• 3.1.1 不同泌乳階段奶牛乳腺組織MEN1 mRNA的表達(dá)分析38-39
• 3.1.2 不同泌乳階段奶牛乳腺組織menin蛋白的表達(dá)分析39
• 3.1.3 不同泌乳階段奶牛乳腺組織menin蛋白的表達(dá)部位分析39-40
• 3.2 奶牛MEN1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建40-41
• 3.2.1 MEN1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果40-41
• 3.2.2 重組載體的酶切鑒定41
• 3.2.3 重組質(zhì)粒的測序鑒定41
• 3.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)的生物學(xué)性狀檢測41-43
• 3.3.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)觀察41-42
• 3.3.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長曲線42-43
• 3.4 真核細(xì)胞奶牛Menin過表達(dá)轉(zhuǎn)染體系的建立43-48
• 3.4.1 MAC-T細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myc-His-bmen1載體最佳條件的確定43-44
• 3.4.2 CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myc-His-bmen1載體最佳條件的確定44-46
• 3.4.3 C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myc-His-bmen1載體最佳條件的確定46-48
• 3.5 MAC-T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA條件的確定48-52
• 3.5.1 MAC-T細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后MEN1 mRNA的表達(dá)分析50
• 3.5.2 MAC-T細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后Menin蛋白的表達(dá)分析50-52
• 3.6 Menin過表達(dá)對(duì)MAC-T細(xì)胞的影響52-54
• 3.6.1 Menin過表達(dá)對(duì)MAC-T細(xì)胞增殖的影響52
• 3.6.2 Menin過表達(dá)對(duì)MAC-T細(xì)胞周期的影響52-54
• 3.6.3 Menin過表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)因子的表達(dá)分析54
• 3.7 Menin限量表達(dá)對(duì)MAC-T細(xì)胞的影響54-58
• 3.7.1 Menin限量表達(dá)對(duì)MAC-T細(xì)胞增殖的影響54-55
• 3.7.2 Menin限量表達(dá)對(duì)MAC-T細(xì)胞周期的影響55-57
• 3.7.3 Menin限量表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)因子的表達(dá)分析57-58
• 4 討論58-61
• 4.1 MEN1/Menin在奶牛不同生理階段的乳腺組織中的表達(dá)58-59
• 4.2 真核細(xì)胞中奶牛MEN1/Menin過表達(dá)轉(zhuǎn)染體系的建立59
• 4.3 Menin過表達(dá)對(duì)細(xì)胞的影響59-60
• 4.4 Menin限量表達(dá)對(duì)細(xì)胞的影響60-61
• 5 結(jié)論與研究展望61-63
• 5.1 結(jié)論61
• 5.2 創(chuàng)新點(diǎn)61
• 5.3 研究展望61-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1007915