本文關(guān)鍵詞：冠心病患者血漿高密度脂蛋白組分功能與機(jī)體炎癥狀態(tài)的相關(guān)性研究

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【摘要】：第一部分：冠心病患者血漿高密度脂蛋白組分與血漿炎癥相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性研究研究背景：炎癥是促進(jìn)冠心病(coronary artery disease, CAD)發(fā)生、發(fā)展的重要因素。已有研究表明血漿炎癥指標(biāo)與CAD的關(guān)系密切,尤其是在急性冠脈病變患者中,血漿中某些急性時相反應(yīng)蛋白和炎癥因子的水平升高意味著預(yù)后不良。然而,這些炎癥相關(guān)指標(biāo)與穩(wěn)定性冠心病(stable coronary artery disease, sCAD)之間的關(guān)聯(lián)研究甚少。而炎癥促進(jìn)CAD的具體機(jī)制尚不明確。血漿高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)可通過促進(jìn)組織細(xì)胞內(nèi)的膽固醇外流、抗炎癥及抗氧化反應(yīng),以及直接的內(nèi)皮保護(hù)功能抑制動脈粥樣硬化。血漿高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平過低是心血管疾病發(fā)生的獨立危險因素。然而,最近發(fā)現(xiàn)高血漿HDL-C水平者仍然存在發(fā)生急性心肌梗死的風(fēng)險,CAD患者血漿HDL-C水平預(yù)測心臟事件的能力下降,有可能與CAD患者血漿HDL的保護(hù)功能減弱或喪失有關(guān)。越來越多的研究證實炎癥是引起血漿HDL功能及組分改變的重要因素之一,而CAD患者體內(nèi)長期存在的慢性炎癥有可能通過干擾HDL代謝引起HDL-C水平及HDL組分的改變,進(jìn)而影響了HDL正常生理功能的發(fā)揮。血清淀粉樣蛋白(serum amyloid A, SAA)是一種由肝臟合成的急性時相反應(yīng)蛋白,炎癥反應(yīng)時,血漿SAA水平升高,且可摻入HDL顆粒中,影響HDL的功能。本課題組的前期研究已發(fā)現(xiàn),CAD患者血漿HDL中的SAA水平升高。因此,為了進(jìn)一步研究CAD患者體內(nèi)炎癥狀態(tài)與HDL組分中SAA (HDL-associated SAA)水平的關(guān)系以及炎癥相關(guān)指標(biāo)在CAD診斷中是否具有價值,本研究擬從以下研究目的入手,進(jìn)行研究。研究目的：1.比較穩(wěn)定性冠心病(stable coronary artery disease, sCAD)患者、急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)患者與非CAD對照者之間血漿炎癥相關(guān)指標(biāo)[急性時相反應(yīng)蛋白hsCRP(高敏C反應(yīng)蛋白)、AAT(α1-抗胰蛋白酶)和SAA/炎癥因子IL-6(白細(xì)胞介素-6)和MCP-1(單核細(xì)胞趨化蛋白-1)]水平的差異。2.評價單獨或聯(lián)合檢測上述血漿炎癥相關(guān)指標(biāo)在CAD診斷中的價值。3.分析比較CAD患者(包括sCAD及ACS患者)血漿HDL-C水平、HDL-associatedSAA水平與上述血漿急性時相反應(yīng)蛋白／炎癥因子水平之間的相關(guān)性。研究方法：1.臨床病例收集：本研究共納入經(jīng)冠狀動脈造影確診的CAD患者116例及性別、年齡相匹配的非CAD對照患者65例。根據(jù)患者胸痛發(fā)作的特點及心肌酶學(xué)等檢查結(jié)果,將CAD組進(jìn)一步分為穩(wěn)定性冠心病(stable coronary artery disease, sCAD, n=42)及急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS, n=74)兩亞組。2.實驗室指標(biāo)檢測：所有研究對象采集空腹靜脈血,超速密度梯度離心法分離提取血漿HDL。采用BCA法檢測血漿HDL樣品中的蛋白含量,免疫印跡法鑒定HDL樣品中載脂蛋白A-I的富集。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)技術(shù)檢測血漿α1-抗胰蛋白酶(al-antitrypsin, AAT)水平、血漿SAA水平以及HDL組分相關(guān)的SAA水平。液相芯片技術(shù)檢測血漿白細(xì)胞介素-6 (interleukine-6, IL-6)及單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)的水平。3.數(shù)據(jù)分析：統(tǒng)計學(xué)方法比較各組間上述急性時相反應(yīng)蛋白/炎癥因子血漿水平的差異。Logistic回歸分析上述炎癥指標(biāo)與CAD發(fā)病之間的關(guān)系。受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線評價上述指標(biāo)單獨或聯(lián)合檢測在診斷CAD方面的價值。非參數(shù)Z檢驗比較不同指標(biāo)在CAD診斷中的價值差異。Pearson或Sperman相關(guān)性分析評價血漿HDL-C水平、HDL-associated SAA水平與上述急性時相反應(yīng)蛋白/炎癥因子血漿水平的相關(guān)性。研究結(jié)果：1.與非CAD對照組相比較,ACS患者血漿hsCRP、AAT、SAA、IL-6以及MCP-1的水平均明顯升高[hsCRP:2.59 (1.07-5.31) mg/L vs.1.21 (0.70-2.07) mg/L, P0.001; AAT:151.55±22.17 mg/dl vs.137.35±12.67 mg/dl, P=0.005; SAA: 9.54 (2.92-24.50)μg/ml vs.4.99(2.53-9.88)μg/ml, P0.001; IL-6:2.37 (1.57-6.30) pg/ml vs.1.77 (1.175-2.62) pg/ml, P0.001; MCP-1:305.26 (244.96-373.29) pg/ml vs.281.29 (225.74-344.01) pg/ml, P=0.013]。而在sCAD患者中,除血漿MCP-1水平外[264.15 (215.35-391.30) pg/ml vs.281.29 (225.74-344.01) pg/ml,P=0.213], hsCRP、AAT、SAA及IL-6的血漿水平均高于非CAD對照組[hsCRP:2.20(1.27-3.45)mg/L vs.1.21(0.70-2.07)mg/L, P=0.001; AAT:148.90±26.36 mg/dl vs.137.35±12.67 mg/dl, P=0.047; SAA:7.04 (4.26-15.63)μg/ml vs.4.99(2.53-9.88)μg/ml,P=0.004; IL-6:2.46(1.66-4.01) pg/ml vs.1.77 (1.175-2.62) pg/ml,P=0.026]。上述各炎癥指標(biāo)在ACS患者與sCAD患者之間的差異均未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。2.多因素Logistic回歸分析顯示：在校正了其他傳統(tǒng)的心血管危險因素后,血漿IL-6水平與SAA水平仍與CAD相關(guān)(IL-6:OR=5.384,95%CI:1.194-24.283, P=0.029; SAA:OR=5.205,95%CI:1.326-20.423。3.CAD患者血漿hsCRP. SAA以及IL-6水平與冠狀動脈狹窄程度相關(guān)(hsCRP: r=0.274,P=0.004; SAA:r=0.215, P=0.025; IL-6:r=0.210,P=0.027)。4.聯(lián)合上述指標(biāo)可提高CAD的診斷價值,ROC曲線下面積AUC=0.849,95%CI: 0.776-0.906,顯著高于各指標(biāo)單獨檢測(P均0.05),敏感度為63.3%,特異度為88.2%。5.相關(guān)性分析顯示：血漿HDL-C水平與hsCRP水平的相關(guān)性僅存在于總研究人群中(r=-0.192, P=0.011)。CAD患者中血漿HDL-C與hsCRP水平之間無顯著相關(guān)性(r=-0.132,P=-0.165),而HDL-associated SAA水平則與上述各炎癥指標(biāo)均具有顯著的相關(guān)性(hsCRP:r=0.584,P0.001;AAT:r=0.221,P0.001; SAA: r=0.740,P0.001; IL-6:r=0.412, P0.001; MCP-1:r=-0.242, P=0.009)。研究結(jié)論：1.CAD患者體內(nèi)存在慢性炎癥反應(yīng)。無論sCAD或ACS患者血漿炎癥相關(guān)指標(biāo)(hsCRP、AAT、SAA、IL-6和MCP-1)水平均顯著升高。2.高血漿IL-6和SAA水平可能增加冠心病的發(fā)生風(fēng)險。3.應(yīng)用上述炎癥相關(guān)指標(biāo)聯(lián)合檢測可提高CAD的診斷能力。4.血漿炎癥指標(biāo)與HDL-associated SAA水平具有相關(guān)性,而HDL-C僅與hsCRP水平呈弱的負(fù)相關(guān)性。提示：HDL組分相關(guān)蛋白可能是與疾病狀態(tài)關(guān)系更為密切的指標(biāo),可能成為CAD的診治靶點。第二部分：冠心病患者血漿HDL促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥激活的機(jī)制研究研究背景：一直以來,血漿高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)被認(rèn)為具有心血管保護(hù)功能。健康人血漿HDL能夠顯著抑制多種致動脈粥樣硬化性物質(zhì)所引起的血管內(nèi)皮損傷。HDL生理功能的發(fā)揮依賴于其組成成分及含量的正常。然而,最近證實：在某些疾病時,血漿HDL存在不同程度的功能障礙。其中,炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致HDL組分及其功能改變的重要因素之一。冠心病(coronary artery disease, CAD)是一種血管壁的慢性炎癥性疾病,已有研究報道CAD患者血漿HDL的內(nèi)皮保護(hù)功能受損,但具體機(jī)制尚不清楚,推測CAD患者體內(nèi)長期存在的慢性炎癥反應(yīng)促使血漿HDL組分改變可能是部分原因。血清淀粉樣蛋白A (serum amyloid A, SAA)是肝臟合成的一種急性時相反應(yīng)蛋白,本課題組前期工作及國內(nèi)外其他研究小組均已證實CAD患者血漿HDL組分中SM的含量顯著增加。富集了SAA的血漿HDL其抗炎能力減弱,但具體機(jī)制尚不清楚。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為局部炎癥反應(yīng)的主動參與者,CAD患者的血漿HDL有可能促進(jìn)其炎癥激活。因此,本部分研究擬從CAD患者的HDL是否能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子入手,探討其對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥發(fā)生的機(jī)制。研究目的：1.觀察比較CAD患者與非CAD對照組血漿HDL對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥激活的影響。2.研究CAD患者血漿HDL對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥激活的信號通路。3.探索SAA富集在CAD患者血漿HDL促炎性功能轉(zhuǎn)變中的作用。研究方法：本研究納入經(jīng)冠狀動脈造影確診的CAD患者12例,以及性別、年齡相匹配的非CAD對照者10例。所有研究對象留取空腹靜脈血,應(yīng)用密度梯度超速離心法分離提取血漿HDL,即為HDLCAD和HDLcontrol。將對照組血漿與重組人SAA于體外條件下共同孵育,分離提取血漿HDL,即為富含SAA的HDL (HDL-bound-SAA)。分別以濃度為100μg/ml的HDLCAD、HDLcontrol與HDL-bound-SAA處理體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),觀察不同干預(yù)對內(nèi)皮細(xì)胞炎癥激活狀態(tài)的影響。以下述指標(biāo)判斷內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥激活狀態(tài)：(1)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB) p65亞基的入核情況；(2)Realtime-PCR及ELISA方法檢測白細(xì)胞介素-6 (interleukine-6, IL-6)及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)的表達(dá)與分泌情況；(3)Realtime-PCR及Western blot法檢測細(xì)胞間粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)及Toll樣受體2 (Toll-like receptor 2, TLR2)的表達(dá)。為探索HDLCAD刺激內(nèi)皮細(xì)胞引發(fā)炎癥的可能機(jī)制,分別以TLR2中和抗體阻斷內(nèi)皮細(xì)胞TLR2介導(dǎo)的信號通路,以p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制劑SB203580阻斷該通路的作用,確定富含SAA的HDLCAD誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥發(fā)生的信號通路。研究結(jié)果：1.與HDLcontrol不同,HDLCAD本身可刺激內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB p65亞基向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,顯著上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞IL-6. MCP-1的合成分泌以及ICAM-1的表達(dá)。2.TLR2中和抗體與p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制劑SB203580均可顯著抑制HDLCAD所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、MCP-1的合成分泌以及ICAM-1的表達(dá),說明HDLCAD刺激內(nèi)皮細(xì)胞炎癥指標(biāo)升高是通過TLR2及p38MAPK信號通路激活的。3.與HDLcontrol相比,HDL-bound-SAA可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、MCP-1的合成分泌以及ICAM-1的表達(dá),與HDLcAD對內(nèi)皮細(xì)胞的作用一致。研究結(jié)論：在無其他外源性刺激時,CAD患者血漿HDL本身即可激活內(nèi)皮細(xì)胞炎癥狀態(tài),且該作用是通過TLR2受體與p38MAPK信號通路發(fā)揮的�；颊哐獫{中SAA水平的升高可促使HDL組分中SAA含量增加。而SAA在HDL組分中的富集部分參與了CAD患者血漿HDL功能的促炎性改變。
【關(guān)鍵詞】：冠心病 高密度脂蛋白 血清淀粉樣蛋白A 炎癥因子 急性時相反應(yīng)蛋白 冠心病 高密度脂蛋白 血管內(nèi)皮細(xì)胞 血清淀粉樣蛋白A 炎癥
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R541.4
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-7
• 主要實驗儀器7-9
• 中文摘要9-14
• 英文摘要14-19
• 前言19-21
• 1. 冠心病患者血漿HDL組分與血漿炎癥相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性研究21-58
• 研究背景21-23
• 研究目的23
• 研究方法23-40
• 研究結(jié)果40-51
• 研究小結(jié)51-52
• 討論52-58
• 2. 冠心病患者血漿HDL促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥激活的機(jī)制研究58-95
• 研究背景58
• 研究目的58-59
• 研究對象及方法59-79
• 研究結(jié)果79-90
• 研究小結(jié)90-91
• 討論91-95
• 結(jié)論95-96
• 參考文獻(xiàn)96-102
• 論文綜述102-118
• 參考文獻(xiàn)111-118
• 個人簡歷118-120
• 致謝120-121

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本文編號：951534