發(fā)布時(shí)間：2017-09-30 09:15

  本文關(guān)鍵詞：杜仲苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞分解代謝和凋亡的影響及其作用機(jī)制

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【摘要】：研究背景骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是以多關(guān)節(jié)破壞為主要特征的慢性退行性變疾病,是中、老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)病,主要特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨的破壞、細(xì)胞外基質(zhì)的減少、軟骨下骨的改變和滑膜的炎性改變等。在世界范圍內(nèi),流行病調(diào)查顯示60歲以上的人群中超過(guò)10%患有骨性關(guān)節(jié)炎,是容易被低估的健康問(wèn)題。在X光檢查下可有骨贅的形成和軟骨下骨的硬化等特征性表現(xiàn)。骨性關(guān)節(jié)炎病因不明,與多種因素相關(guān),患者在臨床上的表現(xiàn)不同,癥狀輕微者僅表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)的疼痛,起初為陣發(fā)性,后為持續(xù)性,活動(dòng)時(shí)疼痛加重,上下樓梯時(shí)尤其明顯。近年來(lái),很多骨科相關(guān)專家在OA的發(fā)病原因進(jìn)行了大量的研究,但對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未有確切的定論。長(zhǎng)期以來(lái),OA被認(rèn)為是關(guān)節(jié)的壓力增高(特別是承重關(guān)節(jié)遭受大負(fù)荷壓力和關(guān)節(jié)解剖的不協(xié)調(diào))和軟骨基質(zhì)減弱的結(jié)果。1990年以后隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,這種觀念被慢慢改變。更多的炎性因子及前列腺素被發(fā)現(xiàn)可以促使軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs),從而形成了OA的“炎癥理論”。所以,OA是涉及到軟骨,骨及滑膜釋放炎癥介質(zhì)的極其復(fù)雜的疾病,最終的病理過(guò)程是細(xì)胞基質(zhì)合成與降解的平衡受破壞引起的關(guān)節(jié)組織破壞。另外,在OA病變中發(fā)現(xiàn)有軟骨細(xì)胞凋亡的特征性改變,如染色質(zhì)凝聚、核碎片、細(xì)胞皺縮、凋亡小體等。因此,軟骨細(xì)胞凋亡已被認(rèn)為是關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的病理因素之一, 是OA發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)作為一種致炎細(xì)胞因子,在骨性關(guān)節(jié)炎病理生理過(guò)程中是一個(gè)重要因素,在整個(gè)致炎以及軟骨細(xì)胞凋亡過(guò)程中處于關(guān)鍵地位,是OA病因之一。IL-1β是由軟骨細(xì)胞的單核細(xì)胞,成骨細(xì)胞和滑膜組織產(chǎn)生的,可以促進(jìn)分泌一系列的炎癥因子及分解代謝介質(zhì),可以單獨(dú)或者和其他細(xì)胞因子配合激活炎癥。在OA的病人中,滑膜液,滑膜,軟骨下骨和軟骨中IL-1β水平都有所提高。在兔的膝關(guān)節(jié)中單獨(dú)的注射IL-18會(huì)比注射其他細(xì)胞因子導(dǎo)致更嚴(yán)重的破壞。細(xì)胞的生物活化是由IL-1β介導(dǎo)的,通過(guò)特殊的細(xì)胞表面受體白介素-1I型受體(IL-1RI)結(jié)合實(shí)現(xiàn)的,與正常的細(xì)胞相比,這種受體在OA的軟骨細(xì)胞和滑膜纖維細(xì)胞中增多。正常的軟骨細(xì)胞中軟骨表面的個(gè)別細(xì)胞中存在IL-1,而受創(chuàng)傷,自由基等刺激激活的軟骨細(xì)胞膜上IL-1β受體表達(dá)升高。這種高表達(dá)的IL-1β與軟骨細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,通過(guò)信息傳遞系統(tǒng)將病變的信息傳遞到細(xì)胞內(nèi),從而干擾軟骨細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)。同時(shí),這種不平衡的代謝活動(dòng)可以改變正常軟骨細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能,繼而促進(jìn)軟骨產(chǎn)生炎癥,進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。最終軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解和滑膜炎等組織病變發(fā)生,影響骨及軟骨代謝。同時(shí),IL-1β被證實(shí)是一種從OA軟骨細(xì)胞原位釋放的很關(guān)鍵的細(xì)胞因子,可以提高基質(zhì)降解酶的水平,抑制蛋白多糖的合成,最終導(dǎo)致軟骨的丟失。IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞分解代謝的影響主要是通過(guò)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)的表達(dá)和活化,導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解來(lái)實(shí)現(xiàn)的,可通過(guò)上調(diào)基因mRNA的表達(dá),尤其是增加了MMP3,MMP9,MMP13等的合成,打破了基質(zhì)金屬蛋白酶-組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)的平衡,從而促進(jìn)基質(zhì)大分子降解。MMPs可以特異性裂解膠原分子,導(dǎo)致膠原網(wǎng)受到破壞,使關(guān)節(jié)軟骨抗應(yīng)力能力降低,使軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解,最終軟骨被破壞。此外,IL-1β對(duì)于炎癥反應(yīng)過(guò)程很重要,促使關(guān)節(jié)組織破壞進(jìn)而釋放一些炎癥介質(zhì)如：環(huán)氧酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase, iNOS)。COX-2是以一種限速酶,可以激發(fā)產(chǎn)生前列腺E2((prostaglandin E2, PGE2),一種重要的炎癥及分解代謝過(guò)程中的炎癥介質(zhì)。iNOS在OA的關(guān)節(jié)液中存在可以催化氧化生產(chǎn)大量的一氧化氮(NO)致使軟骨破壞。一氧化氮還可以激活產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs(一種抑制合成膠原和蛋白多糖的分解酶),抑制產(chǎn)生IL-1Ra,加速軟骨細(xì)胞凋亡。IL-1β還可以刺激產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS),導(dǎo)致軟骨降解,最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡,加速OA的發(fā)病進(jìn)程。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),IL-1β可以刺激體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨釋放ROS,經(jīng)過(guò)caspase-3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。同時(shí),實(shí)驗(yàn)研究表明,IL-1β可引起線粒體形態(tài)、功能變化及線粒體退化,引起膜電位下降,線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ以及ATP合成減少。Bcl-2家族控制著線粒體外膜和內(nèi)膜的通透性,其中包括Bax,Bad,Bid等。Bcl-2主要分布于線粒體膜和細(xì)胞質(zhì)中,具有拮抗軟骨細(xì)凋亡的作用；而Bax和Bid等分布于細(xì)胞質(zhì)中,具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡的作用。Bid位于細(xì)胞胞漿中,可以被caspase-8切割成截?cái)嗟腂id(truncated Bid,tBid),tBid有很強(qiáng)的促凋亡活性,轉(zhuǎn)移到線粒體膜并將凋亡信號(hào)傳遞至線粒體,造成線粒體損傷并誘導(dǎo)其激發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)變,釋放有細(xì)胞色素C(Cytochromec,Cytc),引發(fā)細(xì)胞凋亡。目前關(guān)于OA的治療包括非藥物治療、藥物治療和手術(shù)治療,其中,藥物治療是治療骨性關(guān)節(jié)炎中最主要治療和基礎(chǔ)的治療。藥物可以可大致分為非特異性藥物和特異性藥物兩種,均能有效地緩解患者的疼痛、腫脹和關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙等癥狀。藥物的藥理作用是發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵,其主要機(jī)理是阻斷或抑制OA的某一發(fā)病機(jī)制,而達(dá)到治療或改善緩解OA的作用。目前臨床上推薦的治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的一線傳統(tǒng)治療藥物是非甾體抗炎藥(Non steroidal Anti-inflammatory Drugs, NSAIDs)和對(duì)乙酰氨基酚。但是一線藥物長(zhǎng)期使用會(huì)引起腎臟和消化系統(tǒng)的損害,一些研究還顯示對(duì)軟骨有破壞的副作用,這些不良反應(yīng)在臨床中是無(wú)法忽視的,往往限制了臨床使用。傳統(tǒng)的非甾體類抗炎藥對(duì)COX-1和COX-2的抑制作用缺乏選擇性,因此在發(fā)揮治療作用的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生許多毒副作用。近年來(lái)人們認(rèn)識(shí)到,非甾體類抗炎藥的抗炎作用是通過(guò)抑制COX-2來(lái)實(shí)現(xiàn)的,而不良反應(yīng)的產(chǎn)生則是由于藥物同時(shí)抑制了COX-1的活性。有報(bào)道顯示非甾體類抗炎藥引起的消化性潰瘍的發(fā)病率為15%-20%,在常規(guī)用藥劑量下,不同的非甾體類抗炎藥對(duì)胃腸道并發(fā)癥發(fā)生的危險(xiǎn)性也有不同。這些副作用中,藥物性腎損害的后果很嚴(yán)重。其中可引起急性腎功能不全、腎炎、腎乳頭壞死、高血鉀等一些嚴(yán)重的并發(fā)癥。肝損害可以使轉(zhuǎn)氨酶升高嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。以上這些毒副作用幾乎可以涉及到所有的傳統(tǒng)非甾體類抗炎藥,其發(fā)病率遠(yuǎn)高于未服藥的人。其它不良反應(yīng)主要還有血小板降低、再生障礙性貧血等血液疾病和藥物性變態(tài)反應(yīng)疾病。需長(zhǎng)期服用的患者者,往往難以避免其胃腸道和肝、腎等方面的毒副反應(yīng)。由于OA的西藥治療過(guò)程中往往會(huì)帶來(lái)一定的副作用,使越來(lái)越多的研究者轉(zhuǎn)向中草藥的單一成分治療OA的研究,以期尋找一種對(duì)OA治療有效的中草藥提取的單一成分。杜仲苷是一種天然的化合物可以在多種植物的葉子中提取,比如桃葉珊瑚,杜仲等,被證實(shí)有一系列的藥物作用,值得注意的是其較強(qiáng)的抗炎的作用。有研究證實(shí)杜仲苷成分可以有效消除炎癥引起的水腫,具有較強(qiáng)的抗炎作用。最近的文獻(xiàn)還證實(shí)了杜仲苷的抗炎的特質(zhì)是通過(guò)抑制NF-κB通路激活來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此外,有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了杜仲水提物,一種天然的中藥其中含有杜仲苷成分,在骨性關(guān)節(jié)炎模型小鼠中,可以抑制炎癥因子的產(chǎn)生繼而阻止軟骨基質(zhì)降解。為進(jìn)一步研究OA臨床治療方法,尋找一種副作用較小而有效的治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物,以期在臨床上可以聯(lián)合輔助用于OA的臨床治療,本研究通過(guò)構(gòu)建IL-1p誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥模型,利用杜仲苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),從基因和分子水平研究杜仲苷對(duì)軟骨細(xì)胞分解代謝及凋亡的影響情況,從而進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和傳導(dǎo)通路。為中藥單體化合物治療OA提供實(shí)驗(yàn)證據(jù),從而為下一步治療骨性關(guān)節(jié)炎提供一種新的方法。研究方法1.大鼠軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)無(wú)菌條件下切除SD大鼠雙側(cè)后肢,用眼科剪和刀片削下膝關(guān)節(jié)軟骨組織,用37℃的PBS緩沖液沖洗剪下來(lái)的軟骨組織2～3次。將軟骨組織移至離心管,加入1ml 0.25%胰蛋白酶,用眼科剪將滑膜組織剪成1mm4的塊狀組織。再加入2m1胰酶放入37℃孵箱30min,期間震蕩1-2次。拿出離心2000rmp,5min,將上層液體倒掉,用0.2%的Ⅱ型膠原酶消化2h,期間震蕩4-5次,然后離心2000rmp,5min,去除上清,根據(jù)軟骨組織塊的大小及含量的多少加入適量的DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和青、鏈霉素各10萬(wàn)/L雙抗液體),晃動(dòng),攪勻。將含有完全培養(yǎng)基的組織塊均勻地鋪在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),倒置培養(yǎng)瓶,再向培養(yǎng)瓶加入3～4ml完全培養(yǎng)基。擰緊瓶蓋(透氣培養(yǎng)瓶需擰緊,非透氣培養(yǎng)瓶可稍留縫隙)放置于37℃、含有5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),24小時(shí)內(nèi)將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái),使完全培養(yǎng)基完全浸沒(méi)軟骨組織塊,繼續(xù)放在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每天在顯微鏡下每天觀察軟骨組織塊生長(zhǎng)情況。每2-3天換液一次,待組織塊中軟骨細(xì)胞長(zhǎng)出完全后,傳代培養(yǎng),用第二代或者第三代軟骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。2.軟骨細(xì)胞鑒定倒置相差顯微鏡觀察：在軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)期通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察正常軟骨細(xì)胞的形態(tài)、貼壁生長(zhǎng)情況、生長(zhǎng)特性及細(xì)胞密度,在軟骨細(xì)胞的原代,一代,二代分別觀察拍照。阿爾新藍(lán)染色：用PBS溶液輕輕清洗細(xì)胞,去掉全培溶液。然后用4%多聚甲醛固定30min。加入1%的阿爾新藍(lán)溶液,染色過(guò)夜,用DH20漂洗數(shù)次,直至無(wú)色,拿到顯微鏡下觀察拍照。II型膠原免疫組織化學(xué)染色：取一到三代的軟骨細(xì)胞滴在蓋玻片上,使用爬片技術(shù),待細(xì)胞基本生長(zhǎng)成單層后,取出蓋玻片,以4%多聚甲醛固定20min。3%過(guò)氧化氫室溫下孵育10min,PBS緩沖液沖洗3次,每次5min,滴加正常非免疫動(dòng)物血清室溫下孵育10mmin。然后除去血清,滴加1：100兔抗-大鼠Ⅱ型膠原一抗,4℃過(guò)夜。PBS緩沖液沖洗3次,每次5min。滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫下孵育10min,PBS緩沖液沖洗3次,每次5min。DAB顯色,蘇木精復(fù)色,無(wú)水乙醇脫水,中性樹膠封片。正置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。3.杜仲苷對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和毒性作用的測(cè)定：將軟骨細(xì)胞接種于96孔板內(nèi),用1、10、20、50μM的杜仲苷以及完全培養(yǎng)基DMEM刺激24,48小時(shí)。用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測(cè)定細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。4.杜仲苷對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥及分解代謝作用的影響將軟骨細(xì)胞接種于6孔板中,用1、10、20、50μM的杜仲苷及完全培養(yǎng)基DMEM刺激30分鐘,隨后加入10 ng/ml白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)24小時(shí)。用一氧化氮檢測(cè)試劑盒(Griess Reagent)檢測(cè)杜仲苷在不同濃度下對(duì)白細(xì)胞介素-1β的刺激下軟骨細(xì)胞分泌一氧化氮(NO)的情況,用Real-Time PCR法及western blot法檢測(cè)杜仲苷在不同濃度下對(duì)白細(xì)胞介素-1β的刺激下的軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平的表達(dá),進(jìn)而探討杜仲苷對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的炎癥及分解代謝的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。5.白細(xì)胞介素-1β激活軟骨細(xì)胞內(nèi)NF-κB的時(shí)效反應(yīng)將軟骨細(xì)胞接種于6孔板中,用10 ng/ml白細(xì)胞介素-1β以及完全培養(yǎng)基DMEM分別刺激0、0.5、1、2、6小時(shí)。用Western blot檢測(cè)IL-1β誘導(dǎo)下軟骨細(xì)胞中,IKK、IκBα及胞核NF-κB亞基p65的磷酸化及表達(dá)情況,確定NF-κB通路被激活的最強(qiáng)時(shí)間點(diǎn),進(jìn)而探討杜仲苷對(duì)IL-1β激活NF-κB通路的作用機(jī)制。6.杜仲苷對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞激活NF-κB的影響將軟骨細(xì)胞接種于6孔板中,用1、10、20、50μM的杜仲苷及完全培養(yǎng)基DMEM刺激30分鐘,隨后加入10 ng/ml白細(xì)胞介素-1β(IL-1[)2小時(shí)。用Western blot檢測(cè)不同濃度杜仲苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)下軟骨細(xì)胞內(nèi)IKK、IκBα及NF-κB亞基p65的磷酸化表達(dá)情況。用免疫熒光(Immunofluorescence microscopy)檢測(cè)不同濃度杜仲苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)下軟骨細(xì)胞內(nèi)NF-κB亞基p65核轉(zhuǎn)移的情況。7.杜仲苷對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞內(nèi)活性氧族(ROS)提升的影響將軟骨細(xì)胞接種于24孔板和共聚焦皿中,用不同濃度的(1、10、20、50μM)的杜仲苷,10ng/ml的IL-1β,及完全培養(yǎng)基DMEM刺激30分鐘,在熒光酶標(biāo)儀或共聚焦顯微鏡下用熒光探針二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測(cè)杜仲苷是否抑制IL-1p的刺激下軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的ROS。8.杜仲苷對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響將軟骨細(xì)胞接種于6孔板中,用1、10、20、50μM的杜仲苷及完全培養(yǎng)基DMEM刺激30分鐘,隨后加入10ng/ml白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)培養(yǎng)24小時(shí)。收集細(xì)胞,加入帶有綠色熒光的熒光探針FITC標(biāo)記的AnnexinV及碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液,利用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡百分比。9.杜仲苷對(duì)白細(xì)胞介素-1p誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響將軟骨細(xì)胞接種于6孔板中,用1、10、20、50μM的杜仲苷及完全培養(yǎng)基DMEM刺激30分鐘,隨后加入10ng/ml白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)培養(yǎng)24小時(shí)。利用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,每個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)取這些數(shù)據(jù)的平均值,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0完成。多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA方法,在做兩兩比較時(shí)先計(jì)算方差齊性,方差齊性檢驗(yàn)采用Levene's Test,當(dāng)方差齊時(shí)兩兩比較采用Dunnett法,設(shè)IL-1β組為對(duì)照組,方差不齊時(shí)兩兩比較采用Dunnetts T3法；多個(gè)樣本非參數(shù)比較采取多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)(K Independent Samples Test),當(dāng)P0.05時(shí)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.杜仲苷在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)軟骨細(xì)胞無(wú)毒性作用：CCK8結(jié)果顯示,杜仲苷在一定濃度范圍(1、10、20、50μM)對(duì)軟骨細(xì)胞沒(méi)有顯著的毒性作用。不同濃度杜仲苷對(duì)軟骨細(xì)胞的活力影響,采用One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Levene's Test方法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中加入不同濃度杜仲苷得出OD值總體方差齊性(P=0.287)�；诜讲铨R性的方差分析結(jié)果表明各組間關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中OD值的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F24h=1.342,P24h=0.320; F48h=0.103, P48h=0.979,表1-1)。2.杜仲苷抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥及分解代謝RT-PCR結(jié)果顯示在10ng/ml IL-1β刺激下軟骨細(xì)胞內(nèi)的MMP-3、MMP-9、 MMP-13、iNOS、COX-2的]mRNA水平顯著提高,與加入培養(yǎng)基的對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。采用One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Levene's Test方法檢測(cè)總體方差齊性分別是(PMMP-3=0.263, PMMP-9=0.347, PMMP-13=0.414,PiNOS =0.074, Pcox-2=0.253)。基于方差齊性的方差分析結(jié)果表明,其余組與IL-1β組比較,軟骨細(xì)胞中上述基因的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PMMP-3=28.045, P0.05; FMMP-9=19.569, P0.001;FMMP-13=9.679, P=0.002; FiNOS=16.181, P0.001; F cox-2=39.690, P0.001表1-2,1-3,1-4,1-5,1-6,1-7)。 Griess Reagent結(jié)果顯示在10ng/ml IL-1β刺激下NO產(chǎn)生同樣增多,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。對(duì)不同刺激組的軟骨細(xì)胞NO產(chǎn)生水平,采用One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Levene's Test方法檢測(cè)總體方差齊性(P=0.439)�；诜讲铨R性的方差分析結(jié)果表明與IL-1β組比較,其余組NO產(chǎn)生水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=21.297,P0.001,表1-7),隨著濃度的增高抑制的程度隨之增強(qiáng)。Western blot結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果相似,在10ng/mlIL-1β刺激下軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2的蛋白水平也顯著提高,伴隨著加入杜仲苷濃度的增加,軟骨細(xì)胞內(nèi)的MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2蛋白表達(dá)也逐漸被抑制,加入50μM杜仲苷的抑制作用最為明顯。3.杜仲苷抑制白細(xì)胞介素-1β刺激的軟骨細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活在IL-1β的刺激作用下,隨著時(shí)間變化(0、0.5、1、2、6h),NF-κB通路逐漸被激活而后恢復(fù),軟骨細(xì)胞內(nèi)的NF-κB系統(tǒng)內(nèi)的IκBα逐漸降解,IKK磷酸化,而NF-κB的亞基p65的磷酸化程度逐漸增高,在2小時(shí)達(dá)到高峰,6小時(shí)后下降,正常組無(wú)此效應(yīng)。IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞NF-κB系統(tǒng)激活的效應(yīng)能夠被杜仲苷(1、10、20、501μM)所抑制,隨著加入的不同濃度(1、10、20、50μM),抑制作用逐漸增強(qiáng),在50μM濃度下,作用最為明顯。免疫熒光結(jié)果顯示,在IL-1β的刺激作用下,熒光標(biāo)記的NF-κB的亞基p65從細(xì)胞胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),NF-κB通路被激活。被IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞,加入杜仲苷后熒光標(biāo)記的p65多數(shù)存在于細(xì)胞漿內(nèi)而非細(xì)胞核內(nèi),證明了IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞NF-κB系統(tǒng)激活的效應(yīng)能夠被杜仲苷所抑制。4.杜仲苷降低白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞內(nèi)活性氧族(ROS)水平共聚焦顯微鏡下顯示IL-1β能夠顯著提升軟骨細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度,與單純培養(yǎng)基對(duì)照組比有顯著的差異。而加入杜仲苷組軟骨細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯減弱,提示杜仲苷能夠顯著降低IL-1β提升軟骨細(xì)胞ROS的水平。采用One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Levene's Test方法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中加入不同濃度杜仲苷和IL-1β得出ROS水平總體方差齊性(P=0.885)�；诜讲铨R性的方差分析結(jié)果表明,與IL-1β組相比,加入50μM杜仲苷的軟骨細(xì)胞中ROS水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(F=6.003,P=-0.005,表2-2)。5.杜仲苷抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡,加入不同濃度的杜仲苷后,可見(jiàn)軟骨細(xì)胞凋亡活性明顯下降,并呈量效關(guān)系。采用One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Levene's Test方法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中加入不同濃度杜仲苷和IL-1β得出凋亡率總體方差齊性(P=0.082)�；诜讲铨R性的方差分析結(jié)果表明,與IL-1β組相比,加入不同濃度杜仲苷的軟骨細(xì)胞凋亡率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(F=86.66,P0.001,表2-1)。6.杜仲苷抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)在IL-1β刺激下促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9表達(dá)水平增高,而同時(shí)加入杜仲苷與IL-1β組的軟骨細(xì)胞內(nèi)Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平有所降低,對(duì)于凋亡保護(hù)蛋白Bcl-2,IL-1β刺激下并沒(méi)有明顯升高,反而下降,在同時(shí)加入杜仲苷與IL-1β組的軟骨細(xì)胞內(nèi)Bcl-2有所升高。結(jié)論：1.杜仲苷抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞分泌的炎癥介導(dǎo)因子iNOS、COX-2和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3、MMP-9、MMP-13產(chǎn)生。2.杜仲苷抑制白細(xì)胞介素-1β激活軟骨細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路。3.杜仲苷降低白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞內(nèi)活性氧族(ROS)水平。4.杜仲苷抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡及相關(guān)的蛋白表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：杜仲苷 骨性關(guān)節(jié)炎 凋亡 炎癥 軟骨細(xì)胞 基質(zhì)金屬蛋白酶 白細(xì)胞介素-1β NF-κB
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285
【目錄】：

• 摘要3-13
• ABSTRACT13-24
• 第一章 杜仲苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)及分解代謝的影響24-62
• 前言24-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料29-32
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法32-42
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法42
• 1.4 結(jié)果42-55
• 1.5 討論55-59
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 第二章 杜仲苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響62-90
• 前言62-67
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料67-70
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法70-76
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法76-77
• 2.4 結(jié)果77-83
• 2.5 討論83-85
• 參考文獻(xiàn)85-90
• 縮略語(yǔ)詞匯表90-91
• 綜述91-99
• 參考文獻(xiàn)97-99
• 攻讀學(xué)位期間成果99-100
• 致謝100-103
• 統(tǒng)計(jì)證明103

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本文編號(hào)：947342