本文關(guān)鍵詞：RhoC調(diào)控人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的機(jī)制及子癇前期患者臨床資料分析

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【摘要】：背景與目的子癇前期(preeclampsia,PE)/子癇(eclampsia)一直是嚴(yán)重影響孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒健康的產(chǎn)科重癥,其發(fā)病率和致死率均較高,但其發(fā)病原因尚不明確,因此臨床治療多以“對(duì)癥治療”和“適時(shí)終止妊娠”為主要手段,效果不佳。根據(jù)近些年來形成的且被廣泛接受的“兩階段學(xué)說”理論,在早孕期胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲障礙是PE發(fā)生的起始因素,而中晚孕期胎盤源性的致病因子釋放進(jìn)入母血中造成孕婦廣泛性的內(nèi)皮損傷和全身的系統(tǒng)性免疫-炎癥反應(yīng)是PE發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。同時(shí),滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性遷移的不足造成的胎盤形成不良還可能導(dǎo)致流產(chǎn)和胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限,相反,若侵襲性遷移過度則可能引發(fā)葡萄胎、絨毛膜癌以及胎盤植入。因此闡明人類滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性遷移的內(nèi)在機(jī)制和調(diào)節(jié)因素成為解決這些疾病困擾的關(guān)鍵。滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲性遷移是一個(gè)涉及“細(xì)胞形態(tài)極化→細(xì)胞前緣偽足形成→細(xì)胞與靶方向上的胞外基質(zhì)粘連→細(xì)胞尾部撤離原位→粘連結(jié)構(gòu)分解→胞體收縮前移”等多個(gè)環(huán)節(jié)的細(xì)胞生物學(xué)過程,并受到眾多細(xì)胞內(nèi)外因素的精確調(diào)節(jié),其內(nèi)在的分子機(jī)制也未明確。但已有證據(jù)顯示在細(xì)胞動(dòng)態(tài)遷移的過程中,細(xì)胞骨架的聚合和粘連結(jié)構(gòu)的解離貫穿于其中,成為細(xì)胞侵襲性遷移的動(dòng)力基礎(chǔ)和前提條件,同時(shí)也是調(diào)控和干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本課題組成員在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),小G蛋白中的Rho亞家族蛋白成員RhoA和Rho C在人滋養(yǎng)細(xì)胞固有遷移和誘導(dǎo)性遷移中均能發(fā)揮分子開關(guān)作用,其中RhoA主要是通過干擾微絲骨架的有序重組實(shí)現(xiàn)的,而Rho C對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的調(diào)控則依賴于微絲以外的其他未明機(jī)制。已有研究表明,Rho C與體細(xì)胞遷移,特別是腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,且該分子在進(jìn)化上晚于RhoA,對(duì)細(xì)胞凋亡、物質(zhì)和能量代謝等細(xì)胞的基礎(chǔ)生命活動(dòng)幾乎不存在影響,因此,具有良好的藥物開發(fā)和應(yīng)用前景,但Rho C對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移中的調(diào)控機(jī)制有待證明。既往研究顯示,RhoC主要是通過其下游的Rho相關(guān)卷曲-螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiledcoil forming protein kinase,ROCK)發(fā)揮調(diào)控作用,而且Rho C激活后細(xì)胞的內(nèi)微管骨架結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化,而微管又可以與細(xì)胞的重要粘連結(jié)構(gòu)黏著斑發(fā)生相互作用,影響細(xì)胞的黏附和遷移,但作用模式和信號(hào)通路未見報(bào)道。結(jié)合細(xì)胞微管骨架穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)機(jī)制,我們推測(cè)微管結(jié)合蛋白4(microtubule-associatedprotein4,map4)可能是rock影響滋養(yǎng)細(xì)胞微管聚合的關(guān)鍵分子,但作用機(jī)制不清。因此,本研究在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分著重對(duì)rhoc/rock調(diào)控人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移相關(guān)的微管骨架和黏著斑結(jié)構(gòu)方面的可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。然而,由于目前臨床對(duì)于pe的治療措施十分有限,針對(duì)早孕期發(fā)病先導(dǎo)因素的靶向治療研究尚需要較漫長(zhǎng)的研發(fā)過程,而pe的較高發(fā)病率和不良妊娠結(jié)局對(duì)疾病的早期預(yù)測(cè)和防治提出了更為緊迫和現(xiàn)實(shí)的要求。根據(jù)pe發(fā)病的“兩階段學(xué)說”理論,pe患者胎盤釋放大量的不良作用因子(包括il-2、tnf-α、sflt-1等炎性因子和合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡等)進(jìn)入母體血循環(huán),導(dǎo)致患者體內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的系統(tǒng)性免疫-炎癥反應(yīng),凝血-纖溶系統(tǒng)受到嚴(yán)重的影響,其凝血指標(biāo)和血小板參數(shù)對(duì)于預(yù)測(cè)pe意義重大。既往的許多臨床研究由于納入患者的妊娠合并癥和并發(fā)癥干擾,結(jié)論往往不確定,甚至完全相反。因此,本研究在臨床資料分析部分嚴(yán)格制定pe患者的納入標(biāo)準(zhǔn),并對(duì)其凝血指標(biāo)和血小板參數(shù)的變化趨勢(shì)及其對(duì)pe的預(yù)測(cè)價(jià)值進(jìn)行初步探討。此外,在“兩階段學(xué)說”理論中,pe患者孕晚期從胎盤釋放的致病因子(炎性因子和合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡等)可導(dǎo)致母體的多器官損害,大量的臨床證據(jù)均顯示腎臟是其中受損較早、程度較重的器官。因此,本研究在臨床資料分析部分還回顧了pe/子癇患者產(chǎn)前或產(chǎn)后1周內(nèi)的腎活檢的病理學(xué)特征和母兒情況。材料與方法在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)部分,本研究以人滋養(yǎng)細(xì)胞jeg-3細(xì)胞系為主要研究平臺(tái),分別構(gòu)建rhoc蛋白的高表達(dá)和低表達(dá)慢病毒載體,并用相應(yīng)的慢病毒包裝感染jeg-3細(xì)胞,在體外實(shí)現(xiàn)對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞rhoc基因的調(diào)控;然后分別利用transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同rhoc表達(dá)水平的滋養(yǎng)細(xì)胞固有遷移和水平遷移的能力變化,利用transwell小室結(jié)合基質(zhì)膠的侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞中不同rhoc蛋白表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞侵襲功能的影響,利用cck-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在正常培養(yǎng)和低血清培養(yǎng)條件下滋養(yǎng)細(xì)胞中rhoc表達(dá)變化對(duì)于細(xì)胞增殖的作用;再采用免疫印跡法檢測(cè)rhoc高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞中rhoc下游靶分子rocki和rockii蛋白的表達(dá),以及調(diào)節(jié)微管聚合的map4蛋白的表達(dá)差異;為了分析不同rhoc表達(dá)水平的滋養(yǎng)細(xì)胞中微管的聚合和解聚水平,我們先將細(xì)胞中聚合狀態(tài)和游離狀態(tài)的微管蛋白進(jìn)行分離,再用的免疫印跡分別進(jìn)行蛋白水平檢測(cè),同時(shí)還在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)的變化情況;最后運(yùn)用免疫印跡法檢測(cè)不同rhoc表達(dá)水平的jeg-3細(xì)胞中黏著斑蛋白的表達(dá)情況,并用激光共聚焦顯微鏡掃描細(xì)胞中黏著斑結(jié)構(gòu)的排列特征。在pe患者臨床資料分析的第一部分中,本研究首先選取2007年1月至2013年12月間在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的孕婦共173人,其中輕度子癇前期(mildpreeclampsia,mpe)患者53人,重度子癇前期(severepreeclampsia,spe)患者42人,正常對(duì)照組孕婦79人。重點(diǎn)排除了既往有腎病史、胰島素依賴型糖尿病、需要甾體激素治療的哮喘、慢性肝炎(無論是否有肝功能異常)、嚴(yán)重的外傷史、服用抗凝藥物史、口服避孕藥物史、吸煙史、特發(fā)性血小板減少性紫癜、hellp綜合征、妊娠期血小板減少癥或任何類型的血液系統(tǒng)疾病的患者。分別收集每名患者早孕期和晚孕期凝血功能和血小板參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果,再對(duì)其進(jìn)行對(duì)比和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同組別之間的正態(tài)分布變量差異的顯著性采用單因素方差分析多重比較,對(duì)于非參數(shù)變量則采用kruskal-wallis法檢驗(yàn)并進(jìn)行post-hoc分析。比較同一患者不同孕期的相同參數(shù)使用配對(duì)檢驗(yàn),其中正態(tài)分布變量采用fisher'slsd法,而非參變量采用wilcoxon法。最后采用使用受試者工作特征(receiver-operatingcharacteristic,roc)曲線評(píng)估每一項(xiàng)參數(shù)預(yù)測(cè)pe發(fā)病和嚴(yán)重程度的實(shí)際效能,并利用二進(jìn)制回歸分析評(píng)價(jià)篩選出的指標(biāo)對(duì)pe的預(yù)測(cè)價(jià)值。在pe患者臨床資料分析的第二部分中,本研究回顧了從2007年1月至2012年1月間,因病情進(jìn)展或診治需要于妊娠期或分娩后7日內(nèi)在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腎臟內(nèi)科進(jìn)行超聲引導(dǎo)下的細(xì)針經(jīng)皮腎穿刺活檢的spe/子癇患者,共8例。所有患者均排除了糖尿病史、系統(tǒng)性紅斑狼瘡病史、慢性高血壓病史、腎病病史或近期出現(xiàn)的尿路感染。對(duì)這些患者的臨床特點(diǎn)、母兒結(jié)局、母體主要血清學(xué)指標(biāo),并重點(diǎn)觀察和分析了其腎臟病理切片和免疫熒光特征。主要結(jié)果:(一)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)部分1.本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)、rna干擾技術(shù)結(jié)合基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了rhoc高表達(dá)和rhoc干擾慢病毒載體,并利用這兩種慢病毒的包裝成功高效感染293t細(xì)胞模型和jeg-3滋養(yǎng)細(xì)胞,并鑒定和篩選出rhoc持續(xù)高表達(dá)和持續(xù)低表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染jeg-3滋養(yǎng)細(xì)胞株,其rhoc蛋白表達(dá)水平分別顯著高于和低于空載體病毒感染組的滋養(yǎng)細(xì)胞和正常對(duì)照組滋養(yǎng)細(xì)胞。2.在正常細(xì)胞培養(yǎng)的條件下,滋養(yǎng)細(xì)胞中rhoc蛋白表達(dá)水平升高可顯著提高細(xì)胞的固有遷移、水平遷移、侵襲和增殖能力,而rhoc蛋白表達(dá)降低則可顯著抑制細(xì)胞的固有遷移、水平遷移、侵襲和增殖的能力;但在低血清培養(yǎng)條件下,滋養(yǎng)細(xì)胞中rhoc的表達(dá)水平并不會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖造成顯著影響。3.在滋養(yǎng)細(xì)胞中,rhoc下游的靶分子rocki和rockii的蛋白表達(dá)水平與rhoc蛋白表達(dá)高度一致,提示rhoc在細(xì)胞內(nèi)可能通過促進(jìn)rocki和rockii分子的表達(dá)和作用而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng);而在滋養(yǎng)細(xì)胞中,map4蛋白的表達(dá)與rocki和rockii的變化高度一致,提示rhoc可能通過rocki和rockii對(duì)map4的磷酸化而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞遷移的調(diào)控。4.在滋養(yǎng)細(xì)胞中,rhoc蛋白可以對(duì)微管的聚合狀態(tài)和游離狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié),rhoc表達(dá)升高后聚合狀態(tài)微管蛋白顯著增多而游離狀態(tài)微管蛋白顯著減少,微管的結(jié)構(gòu)在形態(tài)學(xué)上聚合增強(qiáng),排列有序;rhoc表達(dá)降低后胞內(nèi)游離狀態(tài)的微管蛋白水平上調(diào)而聚合狀態(tài)的微管蛋白水平下調(diào),微管結(jié)構(gòu)在形態(tài)學(xué)上趨于解聚,排列紊亂。5.在滋養(yǎng)細(xì)胞中,rhoc蛋白表達(dá)與黏著斑蛋白的水平變化相反,rhoc上調(diào)后黏著斑蛋白表達(dá)降低,在形態(tài)學(xué)上黏著斑的結(jié)構(gòu)解離增強(qiáng);rhoc下調(diào)后黏著斑蛋白表達(dá)升高,在形態(tài)學(xué)上黏著斑結(jié)構(gòu)的重構(gòu)增強(qiáng)。(二)pe患者臨床資料分析一1.正常孕婦晚孕期活化部分凝血活酶時(shí)間(activatedpartialthromboplastintime,aptt)、凝血酶原時(shí)間和凝血酶時(shí)間(thrombintime,tt)水平較早孕期降低,而纖維蛋白原(fibrinogen,fib)水平升高,表現(xiàn)出生理性的高凝狀態(tài);晚孕期血小板計(jì)數(shù)(plateletcount,ptcount)水平較早孕期下降而mpv升高,可能是由血小板聚集和消耗以及繼發(fā)性血小板再生所引起。2.pe患者在孕晚期出現(xiàn)了超高凝的狀態(tài),其微血管中微血栓的形成和纖維蛋白的大量產(chǎn)生及繼發(fā)性溶解導(dǎo)致血小板和fib的大量消耗,pe特別是spe患者孕晚期出現(xiàn)aptt和tt延長(zhǎng)以及d-二聚體和平均血小板體積(meanplateletvolume,mpv)的升高,提示其體內(nèi)發(fā)生了內(nèi)源性和外源性凝血途徑的嚴(yán)重紊亂。3.mpv是早期預(yù)測(cè)pe的理想指標(biāo)(以mpv8.95fl為入選標(biāo)準(zhǔn)),也是預(yù)測(cè)pe嚴(yán)重程度的重要潛在標(biāo)志(以mpv9.95fl為入選標(biāo)準(zhǔn))。(三)pe患者臨床資料分析二1.pe/子癇患者腎臟活檢常見的病理特征包括:內(nèi)皮增生、足細(xì)胞空泡形成、腎小球系膜細(xì)胞增殖和腎小管管腔的蛋白管型;2.補(bǔ)體成分(c4)和免疫球蛋白(igm)的沉積,可能導(dǎo)致嚴(yán)重的腎損傷;3.bun/scr比值有成為spe標(biāo)志物的潛力;4.子癇可以發(fā)生于血壓稍高于正常范圍(135/93mmhg)的患者,在臨床工作中必須引起高度的重視;5.妊娠期間的腎活檢僅推薦用于確診和改進(jìn)治療策略,并應(yīng)根據(jù)患者的一般條件,包括血壓和凝血功能等情況酌情實(shí)施。結(jié)論:(1)Rho C對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的固有遷移、水平遷移和侵襲能力具有調(diào)控作用,其主要機(jī)制是通過激活下游靶蛋白R(shí)OCK I和ROCK II來調(diào)節(jié)MAP4分子的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞微管骨架的聚合和黏著斑結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。這些結(jié)果為深入闡明Rho亞家族蛋白調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的細(xì)胞骨架相關(guān)機(jī)制奠定了一定的研究基礎(chǔ),也為開發(fā)新的滋養(yǎng)細(xì)胞遷移調(diào)控靶點(diǎn)進(jìn)而對(duì)PE的發(fā)生進(jìn)行早期預(yù)防提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。(2)正常妊娠晚期孕婦凝血-纖溶系統(tǒng)處于生理性的高凝狀態(tài),表現(xiàn)為血小板數(shù)量的消耗和生成的激活;PE患者的內(nèi)源性和外源性凝血途徑均發(fā)生嚴(yán)重紊亂而出現(xiàn)超高凝的狀態(tài),同時(shí)消耗了血小板和纖維蛋白原,造成患者多器官病變和出血傾向,導(dǎo)致PE發(fā)病或進(jìn)一步加重病情;MPV可作為PE發(fā)病和嚴(yán)重程度的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。這些結(jié)果為PE的凝血特點(diǎn)研究及早期預(yù)測(cè)研究奠定了初步的基礎(chǔ)。(3)內(nèi)皮增生、足細(xì)胞空泡變性、腎小球系膜細(xì)胞增殖和腎小管腔的蛋白管型是PE/子癇患者腎活檢的主要病理表現(xiàn),C4和Ig M的沉積可能是PE患者腎臟損傷和蛋白尿的重要原因。這些結(jié)果為深入研究PE患者器官損害及其機(jī)制提供一定的臨床資料。
【關(guān)鍵詞】：Rho C蛋白 慢病毒載體 RNA干擾 人滋養(yǎng)細(xì)胞 遷移 侵襲 微管 ROCK蛋白 微管結(jié)合蛋白4 黏著斑 子癇前期 子癇 凝血功能 血小板 平均血小板體積 腎臟活檢
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714.244
【目錄】：

• 縮略語表5-8
• 英文摘要8-16
• 中文摘要16-21
• 第一章 前言21-25
• 第二章 RhoC在人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移中的作用25-61
• 2.1 材料與方法25-43
• 2.2 結(jié)果43-55
• 2.3 討論55-60
• 2.4 小結(jié)60-61
• 第三章 RhoC調(diào)控人滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的機(jī)制61-77
• 3.1 材料與方法61-64
• 3.2 結(jié)果64-72
• 3.3 討論72-76
• 3.4 小結(jié)76-77
• 第四章 子癇前期患者凝血指標(biāo)和血小板參數(shù)的特點(diǎn)及其對(duì)疾病預(yù)測(cè)的價(jià)值77-91
• 4.1 材料和方法78-79
• 4.2 結(jié)果79-86
• 4.3 討論86-89
• 4.4 小結(jié)89-91
• 第五章 子癇前期及子癇患者腎活檢的臨床和病理特點(diǎn)91-109
• 5.1 材料與方法91-94
• 5.2 結(jié)果94-102
• 5.3 討論102-107
• 5.4 小結(jié)107-109
• 全文結(jié)論109-111
• 參考文獻(xiàn)111-128
• 文獻(xiàn)綜述一 Rho GTP酶調(diào)控細(xì)胞遷移研究的新進(jìn)展128-141
• 參考文獻(xiàn)135-141
• 文獻(xiàn)綜述二 子癇前期早期篩查和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)研究的新進(jìn)展141-153
• 參考文獻(xiàn)149-153
• 攻讀博士期間發(fā)表的論文153-155
• 攻讀博士期間獲得的項(xiàng)目資助155-156
• 致謝156-157

【參考文獻(xiàn)】

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 熊鈺;出凝血功能改變?cè)谧影B前期發(fā)病機(jī)制中的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：944257