本文關鍵詞：RhoC調(diào)控人滋養(yǎng)細胞遷移的機制及子癇前期患者臨床資料分析

  更多相關文章： Rho C蛋白 慢病毒載體 RNA干擾 人滋養(yǎng)細胞 遷移 侵襲 微管 ROCK蛋白 微管結(jié)合蛋白4 黏著斑 子癇前期 子癇 凝血功能 血小板 平均血小板體積 腎臟活檢

【摘要】：背景與目的子癇前期(preeclampsia,PE)/子癇(eclampsia)一直是嚴重影響孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒健康的產(chǎn)科重癥,其發(fā)病率和致死率均較高,但其發(fā)病原因尚不明確,因此臨床治療多以“對癥治療”和“適時終止妊娠”為主要手段,效果不佳。根據(jù)近些年來形成的且被廣泛接受的“兩階段學說”理論,在早孕期胎盤的滋養(yǎng)細胞侵襲障礙是PE發(fā)生的起始因素,而中晚孕期胎盤源性的致病因子釋放進入母血中造成孕婦廣泛性的內(nèi)皮損傷和全身的系統(tǒng)性免疫-炎癥反應是PE發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。同時,滋養(yǎng)細胞侵襲性遷移的不足造成的胎盤形成不良還可能導致流產(chǎn)和胎兒宮內(nèi)生長受限,相反,若侵襲性遷移過度則可能引發(fā)葡萄胎、絨毛膜癌以及胎盤植入。因此闡明人類滋養(yǎng)細胞侵襲性遷移的內(nèi)在機制和調(diào)節(jié)因素成為解決這些疾病困擾的關鍵。滋養(yǎng)細胞的侵襲性遷移是一個涉及“細胞形態(tài)極化→細胞前緣偽足形成→細胞與靶方向上的胞外基質(zhì)粘連→細胞尾部撤離原位→粘連結(jié)構(gòu)分解→胞體收縮前移”等多個環(huán)節(jié)的細胞生物學過程,并受到眾多細胞內(nèi)外因素的精確調(diào)節(jié),其內(nèi)在的分子機制也未明確。但已有證據(jù)顯示在細胞動態(tài)遷移的過程中,細胞骨架的聚合和粘連結(jié)構(gòu)的解離貫穿于其中,成為細胞侵襲性遷移的動力基礎和前提條件,同時也是調(diào)控和干預滋養(yǎng)細胞遷移的關鍵靶點。本課題組成員在前期實驗中發(fā)現(xiàn),小G蛋白中的Rho亞家族蛋白成員RhoA和Rho C在人滋養(yǎng)細胞固有遷移和誘導性遷移中均能發(fā)揮分子開關作用,其中RhoA主要是通過干擾微絲骨架的有序重組實現(xiàn)的,而Rho C對滋養(yǎng)細胞遷移的調(diào)控則依賴于微絲以外的其他未明機制。已有研究表明,Rho C與體細胞遷移,特別是腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移關系密切,且該分子在進化上晚于RhoA,對細胞凋亡、物質(zhì)和能量代謝等細胞的基礎生命活動幾乎不存在影響,因此,具有良好的藥物開發(fā)和應用前景,但Rho C對人滋養(yǎng)細胞遷移中的調(diào)控機制有待證明。既往研究顯示,RhoC主要是通過其下游的Rho相關卷曲-螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiledcoil forming protein kinase,ROCK)發(fā)揮調(diào)控作用,而且Rho C激活后細胞的內(nèi)微管骨架結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化,而微管又可以與細胞的重要粘連結(jié)構(gòu)黏著斑發(fā)生相互作用,影響細胞的黏附和遷移,但作用模式和信號通路未見報道。結(jié)合細胞微管骨架穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)機制,我們推測微管結(jié)合蛋白4(microtubule-associatedprotein4,map4)可能是rock影響滋養(yǎng)細胞微管聚合的關鍵分子,但作用機制不清。因此,本研究在細胞實驗部分著重對rhoc/rock調(diào)控人滋養(yǎng)細胞遷移相關的微管骨架和黏著斑結(jié)構(gòu)方面的可能機制進行初步探討。然而,由于目前臨床對于pe的治療措施十分有限,針對早孕期發(fā)病先導因素的靶向治療研究尚需要較漫長的研發(fā)過程,而pe的較高發(fā)病率和不良妊娠結(jié)局對疾病的早期預測和防治提出了更為緊迫和現(xiàn)實的要求。根據(jù)pe發(fā)病的“兩階段學說”理論,pe患者胎盤釋放大量的不良作用因子(包括il-2、tnf-α、sflt-1等炎性因子和合體滋養(yǎng)細胞微泡等)進入母體血循環(huán),導致患者體內(nèi)發(fā)生嚴重的系統(tǒng)性免疫-炎癥反應,凝血-纖溶系統(tǒng)受到嚴重的影響,其凝血指標和血小板參數(shù)對于預測pe意義重大。既往的許多臨床研究由于納入患者的妊娠合并癥和并發(fā)癥干擾,結(jié)論往往不確定,甚至完全相反。因此,本研究在臨床資料分析部分嚴格制定pe患者的納入標準,并對其凝血指標和血小板參數(shù)的變化趨勢及其對pe的預測價值進行初步探討。此外,在“兩階段學說”理論中,pe患者孕晚期從胎盤釋放的致病因子(炎性因子和合體滋養(yǎng)細胞微泡等)可導致母體的多器官損害,大量的臨床證據(jù)均顯示腎臟是其中受損較早、程度較重的器官。因此,本研究在臨床資料分析部分還回顧了pe/子癇患者產(chǎn)前或產(chǎn)后1周內(nèi)的腎活檢的病理學特征和母兒情況。材料與方法在細胞學實驗部分,本研究以人滋養(yǎng)細胞jeg-3細胞系為主要研究平臺,分別構(gòu)建rhoc蛋白的高表達和低表達慢病毒載體,并用相應的慢病毒包裝感染jeg-3細胞,在體外實現(xiàn)對人滋養(yǎng)細胞rhoc基因的調(diào)控;然后分別利用transwell小室遷移實驗和劃痕實驗檢測不同rhoc表達水平的滋養(yǎng)細胞固有遷移和水平遷移的能力變化,利用transwell小室結(jié)合基質(zhì)膠的侵襲實驗檢測滋養(yǎng)細胞中不同rhoc蛋白表達水平對細胞侵襲功能的影響,利用cck-8細胞增殖實驗檢測在正常培養(yǎng)和低血清培養(yǎng)條件下滋養(yǎng)細胞中rhoc表達變化對于細胞增殖的作用;再采用免疫印跡法檢測rhoc高表達和低表達細胞中rhoc下游靶分子rocki和rockii蛋白的表達,以及調(diào)節(jié)微管聚合的map4蛋白的表達差異;為了分析不同rhoc表達水平的滋養(yǎng)細胞中微管的聚合和解聚水平,我們先將細胞中聚合狀態(tài)和游離狀態(tài)的微管蛋白進行分離,再用的免疫印跡分別進行蛋白水平檢測,同時還在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察細胞微管結(jié)構(gòu)的變化情況;最后運用免疫印跡法檢測不同rhoc表達水平的jeg-3細胞中黏著斑蛋白的表達情況,并用激光共聚焦顯微鏡掃描細胞中黏著斑結(jié)構(gòu)的排列特征。在pe患者臨床資料分析的第一部分中,本研究首先選取2007年1月至2013年12月間在第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的孕婦共173人,其中輕度子癇前期(mildpreeclampsia,mpe)患者53人,重度子癇前期(severepreeclampsia,spe)患者42人,正常對照組孕婦79人。重點排除了既往有腎病史、胰島素依賴型糖尿病、需要甾體激素治療的哮喘、慢性肝炎(無論是否有肝功能異常)、嚴重的外傷史、服用抗凝藥物史、口服避孕藥物史、吸煙史、特發(fā)性血小板減少性紫癜、hellp綜合征、妊娠期血小板減少癥或任何類型的血液系統(tǒng)疾病的患者。分別收集每名患者早孕期和晚孕期凝血功能和血小板參數(shù)的檢測結(jié)果,再對其進行對比和統(tǒng)計學分析。不同組別之間的正態(tài)分布變量差異的顯著性采用單因素方差分析多重比較,對于非參數(shù)變量則采用kruskal-wallis法檢驗并進行post-hoc分析。比較同一患者不同孕期的相同參數(shù)使用配對檢驗,其中正態(tài)分布變量采用fisher'slsd法,而非參變量采用wilcoxon法。最后采用使用受試者工作特征(receiver-operatingcharacteristic,roc)曲線評估每一項參數(shù)預測pe發(fā)病和嚴重程度的實際效能,并利用二進制回歸分析評價篩選出的指標對pe的預測價值。在pe患者臨床資料分析的第二部分中,本研究回顧了從2007年1月至2012年1月間,因病情進展或診治需要于妊娠期或分娩后7日內(nèi)在第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院腎臟內(nèi)科進行超聲引導下的細針經(jīng)皮腎穿刺活檢的spe/子癇患者,共8例。所有患者均排除了糖尿病史、系統(tǒng)性紅斑狼瘡病史、慢性高血壓病史、腎病病史或近期出現(xiàn)的尿路感染。對這些患者的臨床特點、母兒結(jié)局、母體主要血清學指標,并重點觀察和分析了其腎臟病理切片和免疫熒光特征。主要結(jié)果:(一)細胞學實驗部分1.本研究利用生物信息學技術(shù)、rna干擾技術(shù)結(jié)合基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了rhoc高表達和rhoc干擾慢病毒載體,并利用這兩種慢病毒的包裝成功高效感染293t細胞模型和jeg-3滋養(yǎng)細胞,并鑒定和篩選出rhoc持續(xù)高表達和持續(xù)低表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染jeg-3滋養(yǎng)細胞株,其rhoc蛋白表達水平分別顯著高于和低于空載體病毒感染組的滋養(yǎng)細胞和正常對照組滋養(yǎng)細胞。2.在正常細胞培養(yǎng)的條件下,滋養(yǎng)細胞中rhoc蛋白表達水平升高可顯著提高細胞的固有遷移、水平遷移、侵襲和增殖能力,而rhoc蛋白表達降低則可顯著抑制細胞的固有遷移、水平遷移、侵襲和增殖的能力;但在低血清培養(yǎng)條件下,滋養(yǎng)細胞中rhoc的表達水平并不會對細胞增殖造成顯著影響。3.在滋養(yǎng)細胞中,rhoc下游的靶分子rocki和rockii的蛋白表達水平與rhoc蛋白表達高度一致,提示rhoc在細胞內(nèi)可能通過促進rocki和rockii分子的表達和作用而發(fā)揮生物學效應;而在滋養(yǎng)細胞中,map4蛋白的表達與rocki和rockii的變化高度一致,提示rhoc可能通過rocki和rockii對map4的磷酸化而實現(xiàn)對細胞遷移的調(diào)控。4.在滋養(yǎng)細胞中,rhoc蛋白可以對微管的聚合狀態(tài)和游離狀態(tài)進行調(diào)節(jié),rhoc表達升高后聚合狀態(tài)微管蛋白顯著增多而游離狀態(tài)微管蛋白顯著減少,微管的結(jié)構(gòu)在形態(tài)學上聚合增強,排列有序;rhoc表達降低后胞內(nèi)游離狀態(tài)的微管蛋白水平上調(diào)而聚合狀態(tài)的微管蛋白水平下調(diào),微管結(jié)構(gòu)在形態(tài)學上趨于解聚,排列紊亂。5.在滋養(yǎng)細胞中,rhoc蛋白表達與黏著斑蛋白的水平變化相反,rhoc上調(diào)后黏著斑蛋白表達降低,在形態(tài)學上黏著斑的結(jié)構(gòu)解離增強;rhoc下調(diào)后黏著斑蛋白表達升高,在形態(tài)學上黏著斑結(jié)構(gòu)的重構(gòu)增強。(二)pe患者臨床資料分析一1.正常孕婦晚孕期活化部分凝血活酶時間(activatedpartialthromboplastintime,aptt)、凝血酶原時間和凝血酶時間(thrombintime,tt)水平較早孕期降低,而纖維蛋白原(fibrinogen,fib)水平升高,表現(xiàn)出生理性的高凝狀態(tài);晚孕期血小板計數(shù)(plateletcount,ptcount)水平較早孕期下降而mpv升高,可能是由血小板聚集和消耗以及繼發(fā)性血小板再生所引起。2.pe患者在孕晚期出現(xiàn)了超高凝的狀態(tài),其微血管中微血栓的形成和纖維蛋白的大量產(chǎn)生及繼發(fā)性溶解導致血小板和fib的大量消耗,pe特別是spe患者孕晚期出現(xiàn)aptt和tt延長以及d-二聚體和平均血小板體積(meanplateletvolume,mpv)的升高,提示其體內(nèi)發(fā)生了內(nèi)源性和外源性凝血途徑的嚴重紊亂。3.mpv是早期預測pe的理想指標(以mpv8.95fl為入選標準),也是預測pe嚴重程度的重要潛在標志(以mpv9.95fl為入選標準)。(三)pe患者臨床資料分析二1.pe/子癇患者腎臟活檢常見的病理特征包括:內(nèi)皮增生、足細胞空泡形成、腎小球系膜細胞增殖和腎小管管腔的蛋白管型;2.補體成分(c4)和免疫球蛋白(igm)的沉積,可能導致嚴重的腎損傷;3.bun/scr比值有成為spe標志物的潛力;4.子癇可以發(fā)生于血壓稍高于正常范圍(135/93mmhg)的患者,在臨床工作中必須引起高度的重視;5.妊娠期間的腎活檢僅推薦用于確診和改進治療策略,并應根據(jù)患者的一般條件,包括血壓和凝血功能等情況酌情實施。結(jié)論:(1)Rho C對滋養(yǎng)細胞的固有遷移、水平遷移和侵襲能力具有調(diào)控作用,其主要機制是通過激活下游靶蛋白ROCK I和ROCK II來調(diào)節(jié)MAP4分子的表達,進而影響細胞微管骨架的聚合和黏著斑結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。這些結(jié)果為深入闡明Rho亞家族蛋白調(diào)控滋養(yǎng)細胞遷移的細胞骨架相關機制奠定了一定的研究基礎,也為開發(fā)新的滋養(yǎng)細胞遷移調(diào)控靶點進而對PE的發(fā)生進行早期預防提供了初步的實驗依據(jù)。(2)正常妊娠晚期孕婦凝血-纖溶系統(tǒng)處于生理性的高凝狀態(tài),表現(xiàn)為血小板數(shù)量的消耗和生成的激活;PE患者的內(nèi)源性和外源性凝血途徑均發(fā)生嚴重紊亂而出現(xiàn)超高凝的狀態(tài),同時消耗了血小板和纖維蛋白原,造成患者多器官病變和出血傾向,導致PE發(fā)病或進一步加重病情;MPV可作為PE發(fā)病和嚴重程度的早期預測指標。這些結(jié)果為PE的凝血特點研究及早期預測研究奠定了初步的基礎。(3)內(nèi)皮增生、足細胞空泡變性、腎小球系膜細胞增殖和腎小管腔的蛋白管型是PE/子癇患者腎活檢的主要病理表現(xiàn),C4和Ig M的沉積可能是PE患者腎臟損傷和蛋白尿的重要原因。這些結(jié)果為深入研究PE患者器官損害及其機制提供一定的臨床資料。
【關鍵詞】：Rho C蛋白 慢病毒載體 RNA干擾 人滋養(yǎng)細胞 遷移 侵襲 微管 ROCK蛋白 微管結(jié)合蛋白4 黏著斑 子癇前期 子癇 凝血功能 血小板 平均血小板體積 腎臟活檢
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R714.244
【目錄】：

• 縮略語表5-8
• 英文摘要8-16
• 中文摘要16-21
• 第一章 前言21-25
• 第二章 RhoC在人滋養(yǎng)細胞遷移中的作用25-61
• 2.1 材料與方法25-43
• 2.2 結(jié)果43-55
• 2.3 討論55-60
• 2.4 小結(jié)60-61
• 第三章 RhoC調(diào)控人滋養(yǎng)細胞遷移的機制61-77
• 3.1 材料與方法61-64
• 3.2 結(jié)果64-72
• 3.3 討論72-76
• 3.4 小結(jié)76-77
• 第四章 子癇前期患者凝血指標和血小板參數(shù)的特點及其對疾病預測的價值77-91
• 4.1 材料和方法78-79
• 4.2 結(jié)果79-86
• 4.3 討論86-89
• 4.4 小結(jié)89-91
• 第五章 子癇前期及子癇患者腎活檢的臨床和病理特點91-109
• 5.1 材料與方法91-94
• 5.2 結(jié)果94-102
• 5.3 討論102-107
• 5.4 小結(jié)107-109
• 全文結(jié)論109-111
• 參考文獻111-128
• 文獻綜述一 Rho GTP酶調(diào)控細胞遷移研究的新進展128-141
• 參考文獻135-141
• 文獻綜述二 子癇前期早期篩查和風險預測研究的新進展141-153
• 參考文獻149-153
• 攻讀博士期間發(fā)表的論文153-155
• 攻讀博士期間獲得的項目資助155-156
• 致謝156-157

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李力;;子癇前期研究現(xiàn)狀與思考[J];中國計劃生育和婦產(chǎn)科;2014年01期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 熊鈺;出凝血功能改變在子癇前期發(fā)病機制中的作用[D];復旦大學;2008年

，

本文編號：944257