發(fā)布時間：2017-09-15 09:48

  本文關(guān)鍵詞：齊墩果酸通過膽汁酸受體TGR5減肥作用的分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： G蛋白偶聯(lián)受體 mi R-26a 肥胖 齊墩果酸 肝臟

【摘要】：超重和肥胖已被全世界公認(rèn)為一種慢性疾病。而且肥胖的發(fā)病率已呈急劇的上升趨勢。增加能量消耗是最安全、最有前景的非手術(shù)減肥的方法。G蛋白偶聯(lián)受體(TGR5)同法尼酯受體(FXR)同屬膽汁酸受體,共同調(diào)節(jié)膽汁酸的動態(tài)平衡和信號通路,都能調(diào)節(jié)糖代謝。脂肪分為白色脂肪(WAT)和褐色脂肪(BAT),WAT貯存能量,BAT以產(chǎn)熱的方式消耗能量。TGR5在褐色脂肪(BAT)中的線粒體上高表達(dá),通過膽酸-TGR5-CAMP-D2-T3-UCP通路導(dǎo)致ATP合成降低,從而調(diào)節(jié)能量代謝的動態(tài)平衡達(dá)到減肥效果。齊墩果酸(OA)是TGR5天然植物配體,原用為治療肝炎藥物,后發(fā)現(xiàn)OA可使高脂飲食的動物體重下降,能提高糖耐,但與TGR5關(guān)系不清楚。近來,mi RNAs作為人類疾病潛在的治療新靶標(biāo)得到了大量的關(guān)注。其中,mi R-26a能夠阻止肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗及肝臟過多合成脂質(zhì),表明mi R-26a可作為提高胰島素敏感性及抑制脂質(zhì)、糖合成的潛在新靶標(biāo)。本研究通過建立肥胖小鼠的動物模型,探索天然植物藥齊墩果酸(OA)是否且如何通過褐色脂肪中高表達(dá)的TGR5受體調(diào)節(jié)能量代謝,消耗能量達(dá)到減肥效果作用的分子機(jī)制。通過本研究我們得出如下結(jié)果:TGR5對于OA調(diào)節(jié)肥胖與糖耐受是必要的通過野生型及TGR5-/-小鼠分組后喂養(yǎng)普通食物、高脂食物及OA,二十周后取標(biāo)本測量各項指標(biāo)及葡萄糖糖耐量實驗和胰島素抵抗實驗,RT-PCR實驗等,數(shù)據(jù)表明OA在體外能夠激活TGR5,從而控制小鼠體重及降低高血糖。給予OA干預(yù),動物體重可下降至普通飲食組水平。然而,盡管OA能夠顯著減少高脂飲食組小鼠體重,但與普通飲食組仍存在較大差異。通過測量內(nèi)臟脂肪,結(jié)果顯示OA在高脂飲食動物體脂形成中有著相似的作用。這進(jìn)一步證實OA能夠減少野生型小鼠體脂的聚積,但這種作用在TGR5-/-小鼠身上不能得以體現(xiàn)。這些結(jié)果明確指出TGR5能夠調(diào)節(jié)OA誘導(dǎo)的減肥效應(yīng)。OA對TGR5-/-小鼠也有些微功效,這歸因于OA對FXR或其他蛋白質(zhì)有著輕微的激活作用。接著,我們對比了野生組與TGR5-/-組小鼠的糖耐量。正如所料,兩組小鼠經(jīng)HFD喂養(yǎng)均引起糖耐量增高。而經(jīng)過OA治療,可顯著提高野生組小鼠、而非TGR5-/-小鼠的糖耐量,表明OA提高糖耐具有TGR5依賴性。TGR5的激活可增加mi R-26a表達(dá)將OA作為一種工具來篩選可被TGR5激活調(diào)節(jié)的下游肝臟miRNAs。在我們研究的這些mi RNAs中,mi R-26a能夠被OA顯著上調(diào),但這種上調(diào)效應(yīng)只存在于野生型小鼠,不存在于TGR5-/-小鼠。相比之下,mi R-16a并不受OA或TGR5狀態(tài)的影響。CA顯著上調(diào)mi R-26a的表達(dá)水平。CA對mi R-26a表達(dá)的影響并無FXR依賴性。TGR5的激活上調(diào)巨噬細(xì)胞中mi R-26a表達(dá)用TGR5激動劑OA處理RAW264.7細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞。結(jié)果表明TGR5的激活確實能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞系及Kupffer細(xì)胞中mi R-26a的表達(dá),證明了TGR5在上調(diào)巨噬細(xì)胞中mi R-26a表達(dá)的新功能。而Kupffer細(xì)胞中一些其他mi RNAs,包括mi R-16,mi R-21及mi R-126,則不會受OA的影響。同時,其他細(xì)胞系經(jīng)OA處理后對mi R-26a的表達(dá)沒有影響。JNK信號通路與TGR5誘導(dǎo)mi R-26a表達(dá)下游信號相關(guān)在RAW264.7及Kupffer細(xì)胞中經(jīng)OA處理后JNK磷酸化作用迅速增強(qiáng)。OA刺激可增強(qiáng)野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中JNK氧化磷酸化水平,TGR5-/-小鼠并無此效應(yīng)。這些結(jié)果提示JNK只有在TGR5激活后才會被特異性激活。我們進(jìn)一步研究了抑制JNK信號通路是否會阻斷TGR5依賴性促炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)。給予JNK誘導(dǎo)劑SP600125(10μM),可顯著減少RAW264.7細(xì)胞中OA誘導(dǎo)的mi R-26a轉(zhuǎn)錄。甚至,在CA喂養(yǎng)的正常小鼠肝臟中,mi R-26a的誘導(dǎo)是增加的,而在JNK1-/-小鼠肝臟該誘導(dǎo)受損。這些結(jié)果表明JNK為肝臟中TGR5調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵下游作用分子。啟動子分析確定了OA的反應(yīng)DNA序列位于mi R-26a近側(cè)端我們還把TGR5反應(yīng)的DNA元件定位在mi R-26a前體的近側(cè)端,此處與宿主基因的轉(zhuǎn)錄無關(guān)。這些結(jié)果將首次闡述TGR5調(diào)節(jié)mi R-26a表達(dá)的新機(jī)制,同時將膽汁酸信號調(diào)節(jié)代謝作用與mi RNAs調(diào)節(jié)通路聯(lián)系起來。總之,當(dāng)前的研究證明OA可以通過TGR5調(diào)節(jié)能量代謝達(dá)到減肥的效果,其可以通過JNK依賴途徑增加mi R-26a表達(dá)。因而,我們的研究結(jié)果提供了膽汁酸信號和mi RNAs之間在代謝調(diào)解中一種新的聯(lián)系。這些發(fā)現(xiàn)還表明,通過小分子激活TGR5可以調(diào)節(jié)mi RNAs的表達(dá),以治療肥胖相關(guān)代謝疾病。
【關(guān)鍵詞】：G蛋白偶聯(lián)受體 mi R-26a 肥胖 齊墩果酸 肝臟
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R589.2
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-5
• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-21
• 參考文獻(xiàn)15-21
• 引言21
• 材料與方法21-53
• 1.實驗材料21-27
• 1.1 實驗動物與飼料21-22
• 1.2 實驗試劑與藥品22-23
• 1.3 試劑配制23-25
• 1.4 主要儀器設(shè)備、器械25-26
• 1.5 實驗組分組與干預(yù)26-27
• 2.實驗方法27-31
• 2.1 肥胖小鼠模型的建立（OA對肥胖小鼠飲食的干預(yù)）27-28
• 2.2 第二批肥胖小鼠模型的建立（TGR5其他種類配體對肥胖小鼠飲食的干預(yù)）28-29
• 2.3 OA干預(yù)后胰島素抵抗實驗的檢測29
• 2.4 其他TGR5的不同配體干預(yù)后胰島素抵抗實驗的檢測29-30
• 2.5 OA干預(yù)后血脂（甘油三酯，，磷脂及膽固醇），肝臟重量的檢測30
• 2.6 其他TGR5的不同配體干預(yù)后血脂（甘油三酯，磷脂及膽固醇），肝臟重量的檢測30-31
• 3.各實驗方法操作步驟31-53
• 3.1 Western-blot31-38
• 3.2 RNA提取與RT-PCR38-42
• 3.3 轉(zhuǎn)染-雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/span>42-43
• 3.4 HE染色及免疫組化43-46
• 3.5 空腹血糖、血脂測定與糖耐量試驗46
• 3.6 ELISA法測定血清胰島素水平46-47
• 3.7 小鼠原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)47-49
• 3.8 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離、純化與培養(yǎng)49-50
• 3.9 小鼠原代Kupffer細(xì)胞的分離與純化鑒定50-52
• 3.10油紅O染色52-53
• 3.11統(tǒng)計學(xué)分析53
• 結(jié)果53-64
• 討論64-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-75
• 綜述75-86
• 參考文獻(xiàn)81-86
• 致謝86

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本文編號：855778