發(fā)布時(shí)間：2017-08-31 21:02

  本文關(guān)鍵詞：基于體外細(xì)胞培養(yǎng)的鼠李糖脂毒理與藥理作用研究

  更多相關(guān)文章： 鼠李糖脂 毒性機(jī)理 口服促吸收劑 抗纖維化 表面張力

【摘要】：鼠李糖脂是一種生物表面活性劑,具有優(yōu)越的表／界面活性、低毒性等特點(diǎn),在醫(yī)藥領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。美國環(huán)境保護(hù)局的報(bào)告認(rèn)為大鼠口服鼠李糖脂無毒性(LD505000 mg/kg),然而,較多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂對體外培養(yǎng)的細(xì)胞有較大毒性。迄今為止,未見文獻(xiàn)解釋其大鼠口服是安全的但細(xì)胞毒性卻比較大的矛盾現(xiàn)象。因此,本文首先采用多種細(xì)胞研究鼠李糖脂細(xì)胞毒性的產(chǎn)生機(jī)理；隨后采用靜脈注射給藥的方式驗(yàn)證鼠李糖脂的體內(nèi)安全性,并分別用模擬胃液、蛋白結(jié)合和基于細(xì)胞培養(yǎng)的體外代謝及吸收模型對其體內(nèi)外毒性差異的原因進(jìn)行解析。在此基礎(chǔ)上,本文進(jìn)一步采用體外細(xì)胞模型評價(jià)了其促口服吸收和抗纖維化的作用,開展了鼠李糖脂在醫(yī)藥領(lǐng)域的潛在應(yīng)用研究。首先,本文采用單層貼壁細(xì)胞對鼠李糖脂的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價(jià),并闡釋了其毒性機(jī)理。結(jié)果表明,鼠李糖脂對兩株癌細(xì)胞(HepG2和Caco-2)以及一株正常細(xì)胞系(HK-2)呈現(xiàn)類似的毒性：無血清培養(yǎng)基中,單、雙鼠李糖脂的最小毒性濃度分別為10和20 mg/L；含10%血清培養(yǎng)基中,單、雙鼠李糖脂的最小毒性濃度分別為100和150 mg/L。因此,血清能夠有效減弱鼠李糖脂的細(xì)胞毒性。本文首次發(fā)現(xiàn),鼠李糖脂將培養(yǎng)基表面張力降低至約41 mN/m以下時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞毒性,而血清通過減緩鼠李糖脂引起的培養(yǎng)基表面張力下降抑制其毒性。采用陰離子化學(xué)表面活性劑SDS和SDBS驗(yàn)證培養(yǎng)基表面張力與細(xì)胞毒性之間的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們也在溶液表面張力降至約41 mN/m以下時(shí)引起細(xì)胞毒性,說明通過降低溶液表面張力導(dǎo)致細(xì)胞毒性可能是其共同的細(xì)胞毒性機(jī)理。其次,本文采用靜脈注射給藥方式驗(yàn)證了鼠李糖脂在大鼠體內(nèi)的安全性,并以體外模型解析其體內(nèi)無顯著毒性的原因。與口服相比,鼠李糖脂的靜脈注射毒性略高,在1500 mg/kg時(shí)引起輕微肝腫大和脾臟淤血,但未發(fā)現(xiàn)其它器官毒性。模擬胃酸的結(jié)果表明,鼠李糖脂在胃酸中溶解度比較低,為900 mg/L左右；平衡透析法測得鼠李糖脂的蛋白結(jié)合率為92%以上；凝膠包埋肝細(xì)胞模型預(yù)測鼠李糖脂易被肝臟代謝(肝萃取率在65%左右)；小腸細(xì)胞模型揭示鼠李糖脂極易被小腸吸收(吸收率為100%)。根據(jù)以上體外模型的結(jié)果,我們推測鼠李糖脂口服安全的原因可能是：其大部分在胃酸中析出,少部分被小腸吸收進(jìn)入血液后和血漿蛋白結(jié)合,使其血液濃度較低,其易被肝臟代謝的特性又使其血液濃度進(jìn)一步降低。本文還采用Caco-2細(xì)胞模型分別評價(jià)了鼠李糖脂對三條小腸吸收途徑的影響,考察其促口服吸收的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),150 mg/L的鼠李糖脂分別提高旁路運(yùn)輸藥物(酚紅)和穿細(xì)胞途徑藥物(普萘洛爾)的表觀滲透系數(shù)達(dá)7.4倍和2倍,而且可以使外排蛋白P-gp的活性下降78%。此外,還發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂將花青素在Caco-2模型上的滲透系數(shù)提高到了1.8-2.6倍。最后,本文采用體外上皮和成纖維細(xì)胞模型考察了鼠李糖脂的抗細(xì)胞纖維化作用。以TGF-β1分別誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞A549和人皮膚成纖維細(xì)胞,轉(zhuǎn)化得到肌成纖維細(xì)胞,并評價(jià)了鼠李糖脂對肌成纖維細(xì)胞的特異性毒性。結(jié)果表明鼠李糖脂在基本不影響A549及成纖維細(xì)胞活率和功能的情況下,對肌成纖維細(xì)胞有明顯毒性,誘導(dǎo)其凋亡,有效降低其收縮和分泌膠原的能力,且抑制其特異性蛋白α-SMA的表達(dá)。綜上所述,本文研究了鼠李糖脂的細(xì)胞毒性機(jī)理,并采用體外模型對其動物體內(nèi)安全的原因進(jìn)行了解釋,有助于其在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究；同時(shí)開展了其促口服吸收和抗纖維化的研究,為將其可能作為新藥或新型藥物助劑奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：鼠李糖脂 毒性機(jī)理 口服促吸收劑 抗纖維化 表面張力
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96;TQ423
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第1章 文獻(xiàn)綜述13-30
• 1.1 生物表面活性劑鼠李糖脂概述13-16
• 1.1.1 生物表面活性劑及其應(yīng)用13-14
• 1.1.2 鼠李糖脂概述14-16
• 1.2 鼠李糖脂的安全性及藥理作用的研究16-19
• 1.2.1 鼠李糖脂的生物安全性17
• 1.2.2 鼠李糖脂的細(xì)胞毒性研究17-18
• 1.2.3 鼠李糖脂藥理作用的體內(nèi)研究18
• 1.2.4 鼠李糖脂藥理作用的體外研究18-19
• 1.3 用于新藥評價(jià)的體外細(xì)胞模型19-25
• 1.3.1 藥物吸收評價(jià)模型20-22
• 1.3.2 藥物分布模型22
• 1.3.3 藥物代謝評價(jià)模型22-23
• 1.3.4 藥物排泄評價(jià)模型23
• 1.3.5 藥物毒性評價(jià)模型23-25
• 1.3.6 用于藥理研究的細(xì)胞模型25
• 1.4 纖維化形成機(jī)理和藥物抗纖維化研究25-29
• 1.4.1 纖維化的形成機(jī)理25-27
• 1.4.2 抗纖維化研究進(jìn)展27-29
• 1.5 課題的研究思路29-30
• 第2幸鼠李糖脂的細(xì)胞毒性及機(jī)理研究30-42
• 2.1 引言30
• 2.2 材料與方法30-33
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器30-31
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)31
• 2.2.3 細(xì)胞活率測定31-32
• 2.2.4 培養(yǎng)基表面張力測定32
• 2.2.5 數(shù)據(jù)分析32-33
• 2.3 結(jié)果與討論33-41
• 2.3.1 不同血清含量培養(yǎng)基中鼠李糖脂的細(xì)胞毒性33-37
• 2.3.2 鼠李糖脂的細(xì)胞毒性機(jī)理研究37-39
• 2.3.3 采用化學(xué)表面活性劑印證鼠李糖脂的細(xì)胞毒性機(jī)理39-41
• 2.4 本章小結(jié)41-42
• 第3章 采用體外模型解析鼠李糖脂體內(nèi)外毒性差異42-55
• 3.1 引言42
• 3.2 材料與方法42-47
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器42-43
• 3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)43
• 3.2.3 大鼠尾靜脈注射給藥43-44
• 3.2.4 體內(nèi)器官病理切片檢測44
• 3.2.5 鼠李糖脂的HPLC法測定44
• 3.2.6 鼠李糖脂在胃酸中的溶解度測定44
• 3.2.7 鼠李糖脂的血漿蛋白結(jié)合率測定44-45
• 3.2.8 溶血實(shí)驗(yàn)45
• 3.2.9 鼠李糖脂的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)45-46
• 3.2.10 鼠李糖脂的肝細(xì)胞代謝能力測定46-47
• 3.2.11 數(shù)據(jù)分析47
• 3.3 結(jié)果與討論47-53
• 3.3.1 鼠李糖脂的大鼠尾靜脈注射毒性評價(jià)47-49
• 3.3.2 鼠李糖脂靜脈注射呈低毒性的原因解析49-52
• 3.3.3 大鼠口服鼠李糖脂無毒性的原因解析52-53
• 3.4 本章小結(jié)53-55
• 第4章 采用細(xì)胞模型評價(jià)鼠李糖脂作為口服促吸收劑的可行性55-65
• 4.1 引言55
• 4.2 材料和方法55-58
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器55-56
• 4.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)56
• 4.2.3 藥物滲透性研究56-57
• 4.2.4 羅丹明123在Transwell單細(xì)胞層上的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)能力57
• 4.2.5 羅丹明123和羅丹明110的細(xì)胞積累和外排量測定57-58
• 4.2.6 鼠李糖脂促進(jìn)花青素在小腸的吸收58
• 4.2.7 數(shù)據(jù)分析58
• 4.3 結(jié)果與討論58-64
• 4.3.1 鼠李糖脂對三種藥物吸收途徑的作用58-61
• 4.3.2 鼠李糖脂對P-gp外排蛋白活性的抑制作用研究61-64
• 4.4 本章小結(jié)64-65
• 第5章 鼠李糖脂抗纖維化的機(jī)理研究65-89
• 5.1 引言65
• 5.2 材料與方法65-69
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器65-66
• 5.2.2 成纖維細(xì)胞和A549的培養(yǎng)66-67
• 5.2.3 肌成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化67
• 5.2.4 蛋白印跡(western blot)67
• 5.2.5 細(xì)胞活率測定67-68
• 5.2.6 活細(xì)胞/死細(xì)胞熒光雙染(Calcein-AM/PI染色)68
• 5.2.7 腋原濃度測定68
• 5.2.8 膠原收縮實(shí)驗(yàn)68
• 5.2.9 細(xì)胞凋亡檢測68-69
• 5.2.10 免疫熒光染色69
• 5.2.11 數(shù)據(jù)分析69
• 5.3 結(jié)果與討論69-88
• 5.3.1 A549和成纖維細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)形成肌成纖維細(xì)胞69-72
• 5.3.2 雙鼠李糖脂對轉(zhuǎn)化前后細(xì)胞毒性的評價(jià)72-77
• 5.3.3 雙鼠李糖脂誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化前后的細(xì)胞凋亡77-80
• 5.3.4 雙鼠李糖脂抑制肌成纖維細(xì)胞的膠原分泌80
• 5.3.5 雙鼠李糖脂抑制肌成纖維細(xì)胞的膠原收縮80-81
• 5.3.6 鼠李糖脂下調(diào)肌成纖維細(xì)胞的α-SMA表達(dá)81-84
• 5.3.7 其他表面活性劑驗(yàn)證鼠李糖脂抗纖維化機(jī)理84-86
• 5.3.8 鼠李糖脂抗細(xì)胞纖維化的機(jī)理解析86-88
• 5.4 本章小結(jié)88-89
• 第6章 結(jié)論與展望89-91
• 6.1 總結(jié)89-90
• 6.2 不足之處90
• 6.3 展望90-91
• 論文主要創(chuàng)新點(diǎn)91-93
• 參考文獻(xiàn)93-115
• 攻讀學(xué)位期間的科研成果115

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