本文關鍵詞：HBV基因變異在HBV相關原發(fā)性肝細胞癌中的臨床意義研究

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【摘要】：肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是一種肝細胞來源的原發(fā)性肝癌。世界范圍內HCC每年發(fā)病率約為750000例,并且HCC在男性中位居全球第五位常見腫瘤,在女性中位居第七位常見腫瘤。乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC發(fā)生發(fā)展的主要危險因素。乙肝病毒的進化動態(tài)學的特點是高突變率(10-5核苷酸替換/位點/年),主要是由于乙肝病毒的易于出錯的逆轉錄酶(reverse transcriptase, RT)和其快速的復制率(1011顆粒/天)。文獻報告這些大量發(fā)生的乙肝病毒突變可能會產生重要的生物學影響,并且研究已發(fā)現(xiàn)其與肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)是HBV基因組的一種高度穩(wěn)定的存在形式。其主要作為病毒mRNA和pgRNA的轉錄模板,也是病毒感染和復制的重要標志,被公認為HBV持續(xù)感染和肝臟進行性病理改變的根本原因。乙肝病毒的cccDNA和HBV基因變異一直是相關領域的研究熱點,而乙肝病毒cccDNA和HBV基因變異的關系及其對肝癌的風險尚不清楚。第一部分：HBsAg陰性肝細胞癌患者肝內HBV DNAs水平研究本研究旨在探討中國HBsAg和HBeAg均陰性的原發(fā)性肝癌患者中乙肝病毒在肝細胞內(癌與癌旁)的狀態(tài)和水平,以及HBsAg、HBeAg均陰性的原發(fā)性肝癌患者中的隱匿性乙肝感染(OBI)的臨床特征和OBI對預后的影響。我們采用實時熒光定量TaqMan PCR方法,定量檢測11對(HBsAg陰性)和57對(HBsAg陽性)腫瘤組織(TT)和癌旁組織(ANTT)的乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)和總DNA(tDNA)。這68例HBeAg陰性的HCC患者HCV抗體陰性、術前沒有接受過抗病毒治療。結果顯示11例HBsAg(-)患者中,36%的患者HBsAb(+) HBeAb(+) HBcAb(+)。然而,只有9%的表面抗原陰性的患者是HBsAb(-) HBeAb(+) HBcAb(+),而這種類型在表面抗原(+)組占絕大多數(shù)(93%)。11例HBsAg(-)和HBeAg(-)HCC患者的TT和ANTT HBV tDNAs都可檢測。HBsAg(-)組的乙肝病毒cccDNA和tDNA低于HBsAg(+)組。OBI的患者有較低的肝硬化的風險。結論：肝內HBV DNAs,例如HBV cccDNA和tDNA對HCC的隱匿性乙肝感染診斷和隨訪監(jiān)測中具有重要的意義,在未來轉化醫(yī)學中可輔助臨床醫(yī)師病因分析治療、建立預防乙型肝炎病毒再激活的個體化治療方案。第二部分：HBsAg陽性肝細胞癌患者肝內HBV DNAs水平與HBV突變的相關性研究本研究旨在探討HBV肝內DNAs和病毒變異在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的變化,我們進行了較大樣本的縱向研究。首先探討在肝癌患者(HBsAg陽性)的肝內(TT和ANTT)乙肝病毒變異和病毒水平之間的關系。其次探討HBsAg陽性的HCC患者的臨床特征和乙肝病毒變異對HCC患者術后預后的影響。我們對106例HBV相關HCC腫瘤組織和鄰近的癌旁組織通過實時熒光PCR TaqMan探針法檢測組織中HBVcccDNA和tDNAo采用PCR擴增后測序方法檢測HBV全基因組的突變位點。用單變量和多變量回歸法分析影響肝癌復發(fā)和生存的風險因素。研究發(fā)現(xiàn)患者乙肝病毒基因組pre-S1區(qū)A2962G/C2964A和pre-S2區(qū)C105T變異體有顯著較高的腫瘤HBVcccDNA的水平,而BCP C1766T突變體有較低的腫瘤HBV cccDNA的水平。A2962G /C2964A突變與AFP水平較高有關。結論：本研究對揭示HBV相關原發(fā)性肝癌中乙肝病毒基因組特征,實現(xiàn)臨床個性化病程監(jiān)測和指導乙型肝炎病毒相關HCC患者的預后判斷提供了重要的理論依據(jù)。第三部分：基于二代測序的HBV pre-S基因變異在HBV相關原發(fā)性肝癌中的臨床意義研究本研究旨在一代測序的基礎上,通過二代測序這一高靈敏度和高通量的新技術,針對具有重要功能意義的pre-S區(qū)段進行深度測序。對HBV pre-S基因變異和原發(fā)性肝癌二者之間的相關性進行探索,從而闡述HBV pre-S基因變異在原發(fā)性肝癌(HCC)發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。研究發(fā)現(xiàn)在HCC和慢性乙肝患者(CHB)體內的HBV均是以B/C混合型為主；HCC患者的pre-S區(qū)域的HBV基因復雜度明顯高于CHB患者；HBV cccDNA水平分別與HBV基因型A和B所占百分比(構成比)成負相關(r=-0.369,P= 0.001; r=-0.274, P= 0.012),而與C型構成比成正相關(r=0.338,P=0.002)。然而在HCC患者的癌旁組織中,HBV cccDNA水平與HBV基因型A,B和C型構成比均無明顯相關性；在CHB組中,血清中HBV缺失片段主要集中在nt 2850-2863和nt 2-55。在HCC組中,癌與癌旁組織的HBV缺失片段主要集中在nt 2850-2863, nt 2889-2951, nt 3051-3078, nt 7-27和nt 40-54；血清中的HBV缺失片段主要集中在nt 2850-2864,nt 3152-3197和nt 40-52。文獻報道pre-S突變蛋白可以激活依賴內質網(wǎng)應激信號途徑和不依賴內質網(wǎng)應激信號途徑,從而參與HCC的發(fā)生發(fā)展,具體機制有待深入研究。此外,HCC患者體內HBV pre-S區(qū)的片段缺失情況也明顯高于CHB患者。我們將二代測序技術用于乙型肝炎病毒的序列,復雜度,基因型和缺失片段等方面的研究,可以改變既往一代測序技術在HBV病毒方面的局限性和不足,不僅有利于更加真實和準確地反映病毒在體內的狀況,推進個性化輔助診斷,還將有利于臨床指導隨訪、預后判斷,在臨床轉化醫(yī)學中有可能為未來的個體化治療方案的制定提供幫助。綜上所述,通過本課題的研究,我們發(fā)現(xiàn)HBV cccDNA, HBV突變與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關；肝內HBV DNAs作為乙肝感染的重要標志物在原發(fā)性肝細胞癌動態(tài)監(jiān)測、療效評價中具有潛在的應用前景；同時二代測序技術有望對臨床個性化治療和乙型肝炎病毒有關HCC患者的預后判斷、實現(xiàn)精準醫(yī)療提供新的重要技術手段。
【關鍵詞】：肝細胞癌 cccDNA total DNA HBeAg HBsAg 二代測序
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7;R512.62
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-10
• 文中常用縮略詞表10-12
• 引言12-15
• 第一部分 HBsAg陰性肝細胞癌患者肝內HBV DNAs水平研究15-29
• 一、前言15-16
• 二、材料與方法16-20
• 三、實驗結果20-26
• 四、討論26-29
• 第二部分 HBsAg陽性肝細胞癌患者肝內HBV DNAs水平與HBV突變的相關性研究29-46
• 一、前言29-30
• 二、材料與方法30-33
• 三、實驗結果33-44
• 四、討論44-46
• 第三部分 基于二代測序的HBV pre-S基因變異在HBV相關原發(fā)性肝癌中的臨床意義研究46-94
• 一、前言46-48
• 二、材料與方法48-62
• 三、實驗結果62-90
• 四、討論90-94
• 研究工作小結94-96
• References96-107
• 綜述107-119
• 參考文獻111-119
• 在讀期間發(fā)表論文情況119-120
• 致謝120

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本文編號：709304