本文關(guān)鍵詞：Peroxiredoxin4在卵泡發(fā)育中的作用及其機制研究

  更多相關(guān)文章： 卵泡發(fā)育 卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體 Peroxiredoxin 4 氧化應(yīng)激

【摘要】：研究背景:卵母細(xì)胞發(fā)育是為受精及胚胎發(fā)育做準(zhǔn)備。在這個過程中,卵母細(xì)胞獲得繼續(xù)發(fā)育能力,并且與周圍細(xì)胞相互交流,其中與卵丘細(xì)胞(CCs)和顆粒細(xì)胞的交流對卵母細(xì)胞自身發(fā)展及卵丘細(xì)胞的分化有重要意義。CCs可形成胞質(zhì)突起穿越透明帶,與卵母細(xì)胞的質(zhì)膜建立縫隙連接,形成一個結(jié)構(gòu)和功能完整的合胞體,即為卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs),參與影響卵母細(xì)胞發(fā)育。在哺乳動物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟之前將其周圍卵丘細(xì)胞去除,會影響卵母細(xì)胞的發(fā)育,但若同時與COCs或者CCs共培養(yǎng)可恢復(fù)裸卵的發(fā)育潛能。所以,CCs可支持卵母細(xì)胞發(fā)育成熟,但具體機制目前仍未闡明。在成年女性卵巢中,大部分卵泡發(fā)育結(jié)局為發(fā)生閉鎖,而卵泡閉鎖主要由顆粒細(xì)胞凋亡起始,氧化應(yīng)激/活性氧族(ROS)所導(dǎo)致的凋亡機制是其中重要生理和病理機制之一。由于年齡增長、病理條件下內(nèi)環(huán)境的改變而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷都將影響卵泡的發(fā)育;在體外培養(yǎng)卵泡時加入抗氧化劑,可阻止卵巢顆粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡,進(jìn)而提高卵母細(xì)胞發(fā)育潛能。本實驗室前期工作中構(gòu)建了小鼠COCs蛋白質(zhì)譜系,發(fā)現(xiàn)抗氧化酶家族Peroxiredoxins家族(Prdxs)是其中的重要組份。Prdxs包括Prdx1-6六種成員�？蛇�原ROS中重要成分H202,具有抗氧化與自由基清除作用,可參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要功能。我們發(fā)現(xiàn)抗氧化酶Prdx4在小鼠成熟COC表達(dá)顯著高于未成熟COC(p0.05),于是認(rèn)為Prdx4在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。Prdx4可分為27kD型和錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的31kD型。前者缺乏N-末端信號肽可被分泌到細(xì)胞外,屬于分泌蛋白;后者保留了N-末端信號肽錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。Prdx4可表達(dá)于睪丸組織中,而Prdx4基因敲除的雄性小鼠具有睪丸萎縮,精子減少等表現(xiàn)。但是,關(guān)于Prdx4在女性生殖系統(tǒng)中作用及其分子機制,目前國內(nèi)外還是空白。本課題以COCs體外培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ),采用基因轉(zhuǎn)染Prdx4超表達(dá)或表達(dá)沉默的技術(shù),研究Prdx4在卵泡發(fā)育過程的作用:通過形態(tài)學(xué)觀察卵泡的發(fā)育,以及卵丘細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,篩選Prdx4在顆粒細(xì)胞凋亡通路中涉及的信號分子,探索prdx4通過抗氧化作用抑制卵丘細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)卵泡發(fā)育的分子信號通路。這些研究為探討卵泡發(fā)育障礙相關(guān)疾病(如持續(xù)性無排卵、多囊卵巢綜合癥、卵巢功能減退等)病理生理機制增加了理論基礎(chǔ),為診斷和生物學(xué)輔助治療此類疾病提供新的思路,也有助于輔助生殖技術(shù)體外受精-胚胎移植(ivf-et)過程中未成熟卵體外培養(yǎng)成熟技術(shù)(ivm)技術(shù)的改進(jìn)。材料和方法第一部分:ivf-et患者卵泡液中peroxiredoxin4水平與臨床結(jié)局的相關(guān)性1.通過elisa方法檢測ivf-et患者卵泡液中prdx4水平,比較其在妊娠及未妊娠患者中的差異。2.通過非參數(shù)sperman相關(guān)性分析方法,將prdx4水平與卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)參數(shù)(獲卵數(shù)、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性分析。第二部分:peroxiredoxin4在調(diào)控小鼠卵泡發(fā)育中的作用1.免疫組化方法檢測人卵巢組織中prdx4的表達(dá)及細(xì)胞定位。2.通過realtimepcr、westernblot方法,比較多囊卵巢綜合征患者、圍絕經(jīng)期婦女以及正常育齡婦女卵巢組織中prdx4的表達(dá)差異。3.通過realtimepcr、westernblot,比較人成熟優(yōu)勢卵泡、未成熟卵泡顆粒細(xì)胞中prdx4的表達(dá)。4.免疫組化方法檢測不同生長發(fā)育期小鼠卵巢組織中prdx4的表達(dá)及細(xì)胞定位。5.小鼠原代顆粒細(xì)胞培養(yǎng)過程加入不同濃度h2o2后繼續(xù)培養(yǎng)24h,通過realtimepcr、westernblot方法檢測prdx4表達(dá)改變。6.通過細(xì)胞計數(shù)、mtt以及edu檢測不同濃度h2o2處理后小鼠顆粒細(xì)胞增殖改變,westernblot方法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。7.通過流式細(xì)胞分析方法,檢測不同濃度h2o2處理后小鼠顆粒細(xì)胞凋亡改變;realtimepcr方法檢測凋亡相關(guān)因子的mrna水平。第三部分:peroxiredoxin4促進(jìn)卵泡發(fā)育的機制研究1.體外培養(yǎng)小鼠coc,外源性添加h2o2處理,觀察coc形態(tài)改變。2.重組腺病毒ad-prdx4和ad-prdx4/sirna感染小鼠coc16-18小時后,realtimepcr驗證coc中的prdx4超表達(dá)及干涉的效率。3.h2o2處理coc過程中,同時加入重組腺病毒ad-prdx4或ad-gfp或細(xì)胞內(nèi)ros清除劑tiron處理16-18h后,通過觀察卵丘擴展指數(shù)以及卵母細(xì)胞成熟率評價卵泡發(fā)育情況。4.h2o2處理coc過程中,同時加入重組腺病毒ad-prdx4或ad-gfp或細(xì)胞內(nèi)ros清除劑tiron處理16-18h后,通過tunel檢測卵丘細(xì)胞以及卵母細(xì)胞的凋亡。5.h2o2處理coc過程中,同時加入重組腺病毒ad-prdx4或ad-gfp或細(xì)胞內(nèi)ros清除劑tiron處理16-18h后,通過realtimepcr方法檢測卵丘細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路關(guān)鍵因子,chop10以及grp78mrna表達(dá)水平。6.將coc中卵丘細(xì)胞以及卵母細(xì)胞機械分離,繼續(xù)培養(yǎng)16-18h,觀察卵母細(xì)胞成熟率改變。7.h2o2處理coc過程中,同時加入重組腺病毒ad-prdx4或ad-gfp或細(xì)胞內(nèi)ros清除劑tiron處理16-18h后,檢測卵丘細(xì)胞以及卵母細(xì)胞中camp水平;在裸卵培養(yǎng)過程中加入camp激動劑forskolin,觀察卵母細(xì)胞成熟率。8.h2o2處理coc過程中,同時加入重組腺病毒ad-prdx4或ad-gfp或細(xì)胞內(nèi)ros清除劑tiron處理16-18h后,realtimepcr方法檢測卵母細(xì)胞中自分泌生長因子bmp15及gdf9改變。9.重組腺病毒ad-prdx4/sirna或ad-gfp/sirna感染coc16-18h后,觀察卵丘擴展指數(shù)以及卵母細(xì)胞成熟率。10.ad-prdx4/sirna腺病毒載體感染coc同時加入不同濃度h2o2,觀察卵丘擴展指數(shù)以及卵母細(xì)胞成熟率。第一部分:ivf-et患者卵泡液中peroxiredoxin4水平與臨床結(jié)局的相關(guān)性1.在pcos組和對照組,妊娠婦女卵泡液中prdx4水平均顯著高于未妊娠婦女(pcos組:22.0±1.61ng/mlvs.17.09±1.26ng/ml,p0.05;對照組:22.26±1.65ng/mlvs.16.43±0.97ng/ml,p0.01)。2.卵泡液中prdx4水平與卵母細(xì)胞受精率(r=0.334;p=0.011)及優(yōu)質(zhì)胚胎率(r=0.326;p=0.013)均呈顯著正相關(guān)性。第二部分:peroxiredoxin4在調(diào)控小鼠卵泡發(fā)育中的作用1.在人卵巢組織中,prdx4蛋白主要表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。2.與對照組相比,pcos患者卵巢組織中prdx4mrna水平和蛋白水平均顯著降低,僅為正常育齡婦女的一半(p0.05),圍絕經(jīng)期婦女卵巢組織中prdx4蛋白表達(dá)較育齡期婦女亦顯著降低(p0.05)。3.prdx4在成熟優(yōu)勢卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)高于未成熟優(yōu)勢卵泡顆粒細(xì)胞,在pcos患者體外培養(yǎng)成熟卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)高于未成熟卵泡顆粒細(xì)胞(p0.05),且與體內(nèi)成熟卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。4.prdx4蛋白在各發(fā)育期小鼠卵巢中均主要表達(dá)于顆粒細(xì)胞,且prdx4mrna水平及蛋白水平均隨小鼠年齡增加而升高,至成熟期達(dá)至高峰,表達(dá)量約為胎兒期三倍(p0.01);至老年期降低,與胎兒期表達(dá)量相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。5.小鼠顆粒細(xì)胞暴露于較低濃度h2o2(400μm)時,prdx4表達(dá)水平與h2o2濃度具有正相關(guān)性;當(dāng)h2o2濃度為200μm時,prdx4的mrna及蛋白水平表達(dá)均至最高峰,約為對照組的4倍;當(dāng)h2o2濃度繼續(xù)增加至400μm或者更高,prdx4表達(dá)水平迅速降低。6.加入h2o2處理后,小鼠顆粒細(xì)胞增殖呈劑量依賴性的降低,h2o2濃度為400μm時已有顯著性差異(p0.05);低濃度h2o2(400μm)時,cdk1、cdk4、p21以及p15等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)已見升高,而當(dāng)h2o2濃度升高至400μm或更高濃度,細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平降低。7.h2o2處理后,小鼠顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)生劑量依賴性的增加,在400μmh2o2處理時細(xì)胞凋亡率為35%,較對照組已有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);此時caspase3,caspase9,caspase12以及bcl-2等凋亡因子mrna表達(dá)水平亦顯著升高(p0.01)。第三部分:peroxiredoxin4促進(jìn)卵泡發(fā)育的機制研究1.小鼠coc體外培養(yǎng)過程中加入h2o2后,卵丘擴展指數(shù)及卵母細(xì)胞成熟率呈劑量依賴性降低,并且在h2o2為400μm時即有顯著性差異(p0.01)。2.重組腺病毒ad-prdx4感染coc過程中,只能夠感染外層卵丘細(xì)胞,而不影響卵母細(xì)胞內(nèi)prdx4的表達(dá);重組腺病毒ad-prdx4感染小鼠coc16-18小時后,卵丘細(xì)胞內(nèi)prdx4mrna表達(dá)水平升高3倍(p0.05);同樣,重組腺病毒ad-prdx4/sirna只感染卵丘細(xì)胞,使prdx4的表達(dá)水平降低60%(p0.05)。3.h2o2處理coc過程中,同時加入重組腺病毒ad-prdx4或細(xì)胞內(nèi)ros清除劑tiron處理16-18h后,均可改善由ros導(dǎo)致的卵丘擴展指數(shù)及卵母細(xì)胞成熟率下降(p0.05)。4.在400μmh2o2作用下,coc中卵丘細(xì)胞及卵母細(xì)胞均發(fā)生凋亡;若同時將卵丘細(xì)胞中prdx4超表達(dá)或加入tiron處理,可改善卵丘細(xì)胞及卵母細(xì)胞的凋亡。5.h2o2處理coc后,卵丘細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的重要因子chop10及grp78的表達(dá)水平顯著升高(p0.05);當(dāng)加入重組腺病毒ad-prdx4或加入tiron處理,可顯著抑制兩因子的升高(p0.05)。6.將卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞機械分離后培養(yǎng),卵母細(xì)胞的成熟率無顯著改變(p0.05);同時用h2o2處理,機械分離組和對照組卵母細(xì)胞的成熟率均顯著降低(p0.05);當(dāng)機械分離組同時加入tiron處理或重組腺病毒ad-prdx4,均不會提高卵母細(xì)胞成熟率(p0.05)。7.h2o2處理coc后,卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞中camp含量均顯著升高(p0.05);同時加入細(xì)胞內(nèi)ros清除劑tiron或加入重組腺病毒ad-prdx4時,均可顯著降低camp水平(p0.05);裸卵培養(yǎng)過程中,加入h2o2或者camp激動劑forskolin處理均可顯著抑制卵母細(xì)胞成熟率(p0.05);同時加入重組腺病毒ad-prdx4后卵母細(xì)胞成熟率不發(fā)生顯著改變(p0.05)。8.h2o2處理coc后,卵母細(xì)胞自分泌生長因子bmp15及gdf9均顯著升高(p0.05);同時加入重組腺病毒Ad-Prdx4或Tiron處理,可降低卵母細(xì)胞中兩種因子mRNA水平表達(dá)。9.重組腺病毒Ad-Prdx4/Si RNA或Ad-GFP/SiRNA感染未成熟COCs 16-18h后,卵丘擴展和卵母細(xì)胞成熟率均與對照組無顯著差異(p0.05)。10.COC體外培養(yǎng)過程中,同時加入重組腺病毒Ad-Prdx4/SiRNA及不同濃度H2O2處理,卵丘擴展指數(shù)和卵母細(xì)胞成熟率發(fā)生H2O2劑量依賴性降低;其中400μM H2O2處理時,卵丘擴展指數(shù)和卵母細(xì)胞成熟率較對照組(無Prdx4干涉組)顯著降低(p0.05)。結(jié)論1.IVF-ET患者卵泡液中Prdx4水平與患者卵母細(xì)胞受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率呈顯著正相關(guān)性,妊娠婦女卵泡液中Prdx4濃度顯著高于未妊娠婦女,提示Prdx4可能參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞質(zhì)量,進(jìn)而影響胚胎質(zhì)量,導(dǎo)致妊娠結(jié)局的差異。2.在人和小鼠卵巢組織中,Prdx4主要定位于顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),且與生長發(fā)育密切相關(guān),于性成熟期表達(dá)量最高,青春期前和老年期表達(dá)量均較低。因此,Prdx4與卵巢卵泡發(fā)育密切相關(guān)。3.Prdx4調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的機制:Prdx4表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞中,通過抵御卵泡中氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡發(fā)揮調(diào)節(jié)作用;同時,卵丘細(xì)胞Prdx4可通過cAMP經(jīng)縫隙連接影響卵母細(xì)胞發(fā)育。4.本研究首次探索了卵巢中Prdx4可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激狀態(tài)正向調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的機制,而Prdx4在多囊卵巢綜合征以及圍絕經(jīng)期婦女卵巢組織中均呈低表達(dá),可能為該類疾病患者卵泡發(fā)育障礙的病理機制之一,可為今后臨床進(jìn)行生物學(xué)輔助治療提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：卵泡發(fā)育 卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體 Peroxiredoxin 4 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 摘要4-10
• Abstract10-16
• 前言16-21
• 第一部分IVF-ET患者卵泡液中Peroxiredoxin4水平與臨床結(jié)局的相關(guān)性21-34
• 材料與方法21-28
• 結(jié)果28-31
• 討論31-33
• 小結(jié)33-34
• 第二部分Peroxiredoxin4在調(diào)控小鼠卵泡發(fā)育中的作用34-63
• 材料與方法34-50
• 結(jié)果50-59
• 討論59-62
• 小結(jié)62-63
• 第三部分Peroxiredoxin4促進(jìn)小鼠卵泡發(fā)育的機制研究63-107
• 材料和方法63-85
• 結(jié)果85-100
• 討論100-106
• 小結(jié)106-107
• 研究展望及自我評價107-109
• 結(jié)論109-110
• 參考文獻(xiàn)110-122
• 綜述（一）卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程中的作用122-131
• 參考文獻(xiàn)128-131
• 綜述（二）Peroxiredoxin4在生物體內(nèi)生理及病理功能131-148
• 參考文獻(xiàn)139-148
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況148-149
• 致謝149

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張麗,王雪梅,張文君;經(jīng)陰道超聲對卵泡發(fā)育的監(jiān)測(摘要)[J];齊魯醫(yī)學(xué)雜志;2003年03期

2 鄧蓮,章曉梅,李春華;妊娠相關(guān)血漿蛋白-A在卵泡發(fā)育中的作用[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2004年02期

3 胡漢蘋;不育婦女卵泡發(fā)育類型的探討[J];實用臨床醫(yī)學(xué);2004年04期

4 王雯斌;解金輝;楊秀萍;;胰島素樣生長因子對卵泡發(fā)育的調(diào)控[J];解剖學(xué)雜志;2007年01期

5 �；萜�;任路平;牛怡芳;;卵泡發(fā)育速度加快對受孕成功率的影響[J];山西醫(yī)藥雜志(下半月刊);2009年02期

6 趙惠容;;陰道超聲監(jiān)測小卵泡發(fā)育102例分析[J];華西醫(yī)學(xué);2009年03期

7 邢玉蓮，郝敏，，王劍玲，楊燕生;超聲斷層監(jiān)測卵泡發(fā)育及排卵[J];中國超聲醫(yī)學(xué)雜志;1994年12期

8 鄭云萍;商威;曲俐;;自擬陰育湯促進(jìn)女性卵泡發(fā)育121例[J];遼寧中醫(yī)雜志;2013年12期

9 包文平;藥物誘導(dǎo)卵泡發(fā)育及排卵的臨床超聲觀察[J];浙江臨床醫(yī)學(xué);2000年07期

10 沙紅英,陳建泉,錢e

本文編號：644393