本文關(guān)鍵詞：脾臟截留循環(huán)內(nèi)皮祖細胞及高原環(huán)境對大鼠顱腦損傷修復(fù)的影響

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【摘要】：創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是全球范圍內(nèi)45歲以下人群致死致殘的首要原因,可以減少傷者的預(yù)期壽命。其中重型TBI患者死亡率高達35-70%,絕大部分幸存者均遺留不同程度的功能障礙,針對重型TBI迄今為止仍無有效的治療策略降低死殘率。重型TBI患者的死亡除與年齡大小、原發(fā)損傷嚴重程度、救治是否及時等因素有關(guān)外,繼發(fā)性腦損傷所致創(chuàng)傷性腦水腫已成為影響預(yù)后的重要因素。因此,如何有效控制繼發(fā)性腦損傷的進展以減輕創(chuàng)傷性腦水腫,對降低重型TBI死亡率具有重要的臨床價值及科學(xué)意義。TBI后血管新生是創(chuàng)傷后的一種保護性機制,可減輕神經(jīng)組織繼發(fā)性損傷。對TBI的研究目前主要聚焦于腦保護及神經(jīng)修復(fù)再生,而對腦組織缺血區(qū)供血血管關(guān)注甚少。研究證實在成年人外周血中存在的EPCs能分化為血管內(nèi)皮細胞,在體內(nèi)具有生成血管的能力,血管新生已成為當前再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點,隨著對EPCs認識的加深,既往認為只能靠成熟內(nèi)皮細胞對損傷血管進行有限修復(fù)的觀點被顛覆。EPCs在各種因素刺激下可從骨髓及其它組織動員到循環(huán)血進行損傷的修復(fù)。近年來研究顯示,EPCs是參與生后生理性及病理性血管形成最主要的細胞,同時可在體內(nèi)分化為內(nèi)皮細胞,并參與腦、心、肝、腎等內(nèi)臟器官損傷時的修復(fù)。因此,EPCs在TBI后修復(fù)中具有重要的治療作用及廣闊的應(yīng)用前景。BBB在維持CNS與血循環(huán)之間的內(nèi)穩(wěn)態(tài)起著重要作用,重型TBI后BBB破壞,繼發(fā)創(chuàng)傷性腦水腫形成是重型TBI患者死亡的首要原因。近來研究認為BBB被推薦為TBI一個有希望的治療靶標,穩(wěn)定BBB與神經(jīng)保護劑兩者結(jié)合可以提高治療成功率。在影響TBI后神經(jīng)功能恢復(fù)及遠期預(yù)后的諸多因素中,BBB修復(fù)是其中尤為重要的因素;而EPCs可轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細胞參與血管新生并修復(fù)內(nèi)皮完整性,進而防止BBB損傷、加快神經(jīng)功能恢復(fù)。亦有研究表明循環(huán)EPCs水平與TBI臨床嚴重程度及預(yù)后有關(guān),可作為TBI預(yù)后的一個潛在標志物。當前對重型TBI的大量研究多關(guān)注腦組織本身,針對外周免疫反應(yīng)對TBI的影響缺乏深入研究。近年來研究表明,TBI后繼發(fā)性腦損傷過程中除致傷灶內(nèi)炎癥因子參與外,外周免疫系統(tǒng)亦參與了該過程,促進創(chuàng)傷性腦水腫形成,作為人體最主要的免疫器官,脾臟在TBI后腦水腫形成中有重要作用。脾臟亦是機體最大的淋巴器官,約占體重的0.2%,在清除衰老紅細胞、產(chǎn)生抗體及誘導(dǎo)免疫方面發(fā)揮重要功能,脾監(jiān)視循環(huán)并清除血中潛在威脅內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的異物。脾臟一直被認為是單核細胞的直接貯庫,機體損傷后動員大量單核細胞直接入脾,研究報道在炎性疾病中脾臟受累及,在脾臟中單核細胞數(shù)量不僅比循環(huán)中高出數(shù)倍,而且在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定情況下心肌梗塞后受損心臟單核細胞數(shù)量亦超出循環(huán)。有研究報道實驗性卒中導(dǎo)致脾萎縮及脾源性促炎單核巨噬細胞動員進入血循環(huán),進而聚集在缺血腦組織,脾尺寸的減少與腦梗塞面積程度呈負相關(guān),卒中前2周行脾切除術(shù)具有神經(jīng)保護作用。課題組前期研究證實,重型TBI大鼠傷后立即行脾臟切除,能夠有效減輕腦組織水腫程度,顯著降低大鼠死亡率,并能改善其認知功能,但具體機制尚不清楚。既然循環(huán)EPCs水平與TBI臨床嚴重程度及預(yù)后有關(guān),而在TBI后行脾切除可以減輕腦水腫,兩者之間是否存在某種重要聯(lián)系?脾切除對循環(huán)EPCs水平及BBB通透性會產(chǎn)生什么影響?脾切除是否介導(dǎo)EPCs參與BBB重建?為驗證上述疑問,本研究設(shè)計如下實驗,以明確脾臟在重型TBI后對循環(huán)EPCs的調(diào)控及其參與BBB修復(fù)的機制。除了從內(nèi)因方面探討了重型TBI后脾臟對EPCs的影響及其參與BBB修復(fù)、減輕了創(chuàng)傷性腦水腫,我們還從外因方面初步探討了環(huán)境改變對重型TBI后創(chuàng)傷性腦水腫的影響,對常壓、低壓環(huán)境下穿透性腦損傷的傷情進行比較,以對高原條件下創(chuàng)傷性腦水腫的診治提供依據(jù)。研究內(nèi)容:①建立重型TBI大鼠模型,觀察TBI后立即行脾臟切除對大鼠傷情的影響,主要從血常規(guī)、血糖、死亡率及腦水腫等方面觀察;②對重型TBI后3天大鼠循環(huán)血單個核細胞進行分離、培養(yǎng)及基本生物學(xué)特性鑒定;③脾切除對重型TBI大鼠循環(huán)血EPCs及S100B蛋白的影響及兩者間的相互關(guān)系,制模后不同時間點應(yīng)用流式細胞儀檢測循環(huán)血EPCs,應(yīng)用ELISA檢測血漿S100B蛋白表達;④重型TBI大鼠BBB通透性的改變情況以及脾切除后對BBB通透性的影響;利用攜帶EGFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)染EPCs,經(jīng)尾靜脈移植后,觀察EPCs移植后對創(chuàng)傷性腦水腫的影響及其參與血腦屏障重建的機制,應(yīng)用免疫熒光了解其歸巢至腦損傷灶情況,Western blot檢測GFP及VEGF蛋白的表達;⑤對模擬高原穿透性顱腦損傷傷情的特點進行初步研究,通過建立穿透性腦損傷模型,從死亡率、組織病理改變、腦含水量、EB含量、局部腦血流量、局部腦氧分壓、腦干聽覺誘發(fā)電位等方面比較常壓及低壓環(huán)境對穿透性腦損傷傷情的影響。本次研究得出如下結(jié)果:①建立了穩(wěn)定的大鼠重型TBI模型;進一步印證了重型TBI大鼠傷后行脾切除可有效緩解腦水腫,提高生存率。②應(yīng)用密度梯度離心從循環(huán)血分離獲得的單個核細胞中存在EPCs,在內(nèi)皮條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下可由祖細胞向成熟細胞分化;所培養(yǎng)EPCs經(jīng)流式細胞儀鑒定具有EPCs表型特征,并可攝取Di I-Ac-LDL及結(jié)合FITC-UEA-1;EPCs在Matrigel上能形成小管樣結(jié)構(gòu)。③重型TBI后循環(huán)血EPCs增加,脾切除后循環(huán)血EPCs增加更為顯著;重型TBI后血漿S100B蛋白表達增加,脾切除可以減少其表達;EPCs與血漿S100B蛋白呈正相關(guān)。④大鼠TBI后BBB通透性增加,脾切除可以改善BBB通透性;TBI后行EPCs移植減輕創(chuàng)傷性腦水腫;EPCs參與了TBI后BBB的重建,VEGF可能是EPCs修復(fù)血腦屏障的分子機制。⑤高原創(chuàng)傷性腦水腫較常壓傷情重、發(fā)生快,持續(xù)時間長;早期持續(xù)的r CBF與Pbt O2監(jiān)測對高原穿透性腦損傷的診治具有重要價值。研究結(jié)論:1重型TBI后BBB通透性升高,脾切除可改善BBB通透性;2重型TBI后行脾切除可以升高循環(huán)EPCs,提示脾臟對骨髓來源的EPCs具有截留作用;3重型TBI后EPCs移植可歸巢到損傷灶參與BBB重建,減輕創(chuàng)傷性腦水腫;4高原創(chuàng)傷性腦水腫傷情重、發(fā)生快、持續(xù)時間長,早期持續(xù)的r CBF與Pbt O2監(jiān)測對指導(dǎo)治療具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：脾切除 內(nèi)皮祖細胞 創(chuàng)傷性腦損傷 血腦屏障 腦水腫
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 縮寫語表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 脾臟切除對重型顱腦損傷大鼠傷情的影響16-26
• 2.1 材料與方法16-19
• 2.2 結(jié)果19-23
• 2.3 討論23-25
• 2.4 小結(jié)25-26
• 第三章 重型顱腦損傷大鼠循環(huán)EPCs的分離、培養(yǎng)及基本生物學(xué)特性26-38
• 3.1 實驗材料與方法26-31
• 3.2 結(jié)果31-34
• 3.3 討論34-36
• 3.4 小結(jié)36-38
• 第四章 脾臟切除對重型TBI后循環(huán)EPCs的影響38-52
• 4.1 材料與方法39-44
• 4.2 結(jié)果44-48
• 4.3 討論48-51
• 4.4 小結(jié)51-52
• 第五章 EPCs移植治療促進TBI血腦屏障重建的作用機制52-66
• 5.1 材料與方法52-59
• 5.2 結(jié)果59-63
• 5.3 討論63-65
• 5.4 小結(jié)65-66
• 第六章 模擬高原環(huán)境大鼠開放性顱腦創(chuàng)傷傷情的研究66-78
• 6.1 材料與方法66-71
• 6.2 結(jié)果71-75
• 6.3 討論75-77
• 6.4 小結(jié)77-78
• 全文總結(jié)78-79
• 參考文獻79-87
• 文獻綜述一 EPCs在腦損傷中的研究進展87-103
• 參考文獻95-103
• 文獻綜述二 脾臟在腦損傷中的作用103-112
• 參考文獻107-112
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文112-113
• 致謝113

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本文編號：627232