本文關(guān)鍵詞：AQP4極性表達(dá)變化對出血性腦水腫發(fā)生發(fā)展的影響及其機(jī)制研究

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【摘要】：腦出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是臨床上中老年人的常見病、多發(fā)病,具有高死亡率和高致殘率的特點。腦水腫是腦出血最重要的并發(fā)癥之一,其發(fā)生發(fā)展直接關(guān)系到患者的預(yù)后,因此腦水腫的形成機(jī)制一直是神經(jīng)科學(xué)研究的重點內(nèi)容。腦水腫發(fā)生的關(guān)鍵是腦細(xì)胞內(nèi)、外水電解質(zhì)分布失衡,從而破壞了腦細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)的完整性。水通道蛋白家族(aquaporins,AQPs)的發(fā)現(xiàn),為進(jìn)一步闡明腦內(nèi)水電解質(zhì)運輸平衡及其異常的分子機(jī)制提供了新契機(jī)。AQPs是一類介導(dǎo)水分子高速跨膜轉(zhuǎn)運的細(xì)胞膜通透蛋白,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)水電解質(zhì)平衡中發(fā)揮了重要作用。水通道蛋白4 (aquaporin4,AQP4)是目前發(fā)現(xiàn)的腦內(nèi)表達(dá)最豐富的水通道蛋白。生理情況下,AQP4密集表達(dá)在腦實質(zhì)與腦脊液／血液交界處的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上,參與構(gòu)成膠質(zhì)界膜,其在維持腦內(nèi)動態(tài)水平衡中發(fā)揮了重要作用。研究者們將AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上密集表達(dá)的這一分布模式稱之為AQP4的“極性表達(dá)”(polarized expression)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上的AQP4以正交序列(orthogonal arrays of particles,OAPs)的形式存在,OAPs是AQP4行使其高效水轉(zhuǎn)運功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。生理條件下,AQP4極性表達(dá)在與水轉(zhuǎn)運密切相關(guān)的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上,對維持血腦／血腦脊液間水電解質(zhì)平衡具有至關(guān)重要的作用；而在病理情況下,AQP4極性表達(dá)障礙,OAPs的形成亦明顯降低,AQP4的高效水轉(zhuǎn)運功能障礙,引起血腦／血腦脊液間水平衡紊亂。AQP4極性表達(dá)與肌萎縮蛋白-肌營養(yǎng)不良聚糖蛋白復(fù)合物(dystrophin-dystroglycan complex, DDC)密切相關(guān)。DDC復(fù)合物是一組連接細(xì)胞外基質(zhì)分子與細(xì)胞骨架的相互作用蛋白,其成員包括Dystroglycan(DG),dystrobrevin和syntrophin,核心成員為DG(包括α-DG與p-DG)。β-DG是跨膜分子,在細(xì)胞外經(jīng)α-DG與細(xì)胞外基質(zhì)連接,在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞骨架連接,并通過a-syntrophin將AQP4極性錨定到星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上。研究發(fā)現(xiàn),DG基因敲除后,血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上的AQP4極性表達(dá)缺失,提示其在AQP4極性定位中發(fā)揮了重要作用。對于ICH這種常見病、多發(fā)病,目前的研究集中在ICH腦組織中AQP4表達(dá)量的變化上,而對AQP4極性表達(dá)是否變化,極性表達(dá)變化是否與出血性腦水腫相關(guān),目前尚未見報導(dǎo)。為此,本課題擬應(yīng)用自體血注入法建立ICH動物模型,研究AQP4極性表達(dá)變化對出血性腦水腫發(fā)生發(fā)展的影響,以及研究AQP4的錨定蛋白β-DG對AQP4極性表達(dá)變化的影響,以期為腦水腫形成的分子機(jī)制研究提供實驗基礎(chǔ)以及為腦水腫治療提供新思路。研究目的1.研究AQP4在ICH腦組織中的表達(dá)變化,以及AQP4極性表達(dá)變化對出血性腦水腫發(fā)生發(fā)展的影響；2.研究DDC復(fù)合物的核心成員β-DG與AQP4在ICH腦組織中的表達(dá)變化,以初步探討β-DG對AQP4極性表達(dá)變化的影響。研究內(nèi)容與方法健康成年雄性SD大鼠204只,隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(sham組)與ICH組(ICH后1 d、3 d、7 d)。采用自體血注入法建立大鼠ICH動物模型,應(yīng)用核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)檢測血腫產(chǎn)生及發(fā)展,干濕重法檢測腦水含量變化,伊文斯蘭(Evans Blue,EB)注入法檢測血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性改變,透射電鏡和HE染色檢測組織病理結(jié)構(gòu)變化,免疫印跡和實時熒光定量PCR檢測血腫周圍組織中AQP4蛋白及其mRNA表達(dá)變化,免疫熒光雙標(biāo)記檢測AQP4的極性表達(dá)變化,免疫熒光雙標(biāo)記檢測AQP4與β-DG的共表達(dá)變化,免疫印跡和實時熒光定量PCR檢測血腫周圍組織中β-DG蛋白及其mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果1.ICH腦組織中AQP4極性表達(dá)缺失MRI檢測顯示所有模型組均有明顯的邊界清楚的血腫,ICH后1d的血腫直徑最大,表明50μl自體血注入大鼠尾狀核后,成功的建立了ICH動物模型。ICH后1d、3d的腦水含量明顯增高,與sham組比較,差值具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。ICH后1d、3 d血腫周圍組織中的EB含量均明顯增高,與sham組比較,差值具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；HE染色和透射電鏡檢測發(fā)現(xiàn)血腫周圍組織結(jié)構(gòu)破壞明顯,以ICH后1d為甚,可見血管周圍間隙增寬,毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿腫脹,胞漿內(nèi)出現(xiàn)小泡、小囊等結(jié)構(gòu)。ICH后1 d,血腫周圍組織中,AQP4蛋白與mRNA含量均明顯增高,與sham組比較,差值具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與sham比較,ICH后3 d、7 d的AQP4蛋白與mRNA含量均無明顯變化,差值不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果顯示,sham組中,AQP4極性表達(dá)在軟腦膜下外膠質(zhì)界膜、室管膜細(xì)胞基底部及其下的內(nèi)膠質(zhì)界膜以及尾狀核毛細(xì)血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上；而ICH組,AQP4成團(tuán)的聚集在外膠質(zhì)界膜、彌散性的表達(dá)在整個室管膜細(xì)胞,以及表達(dá)到血腫周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體和突起上,即ICH腦組織中,AQP4極性表達(dá)缺失。2.β-DG表達(dá)下調(diào)與AQP4極性表達(dá)缺失密切相關(guān)對照組中AQP4與β-DG共表達(dá)在軟腦膜下外膠質(zhì)界膜、室管膜細(xì)胞基底部及其下的內(nèi)膠質(zhì)界膜、腦實質(zhì)毛細(xì)血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上；而ICH組,在血腫周圍組織、室管膜細(xì)胞及外膠質(zhì)界膜上的AQP4極性表達(dá)缺失,同時伴隨著B-DG在上述部位的表達(dá)明顯降低,僅可見稀疏的、散在的位于星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體上的陽性表達(dá)。而在穹窿下器官、視上核、海馬、齒狀回等AQP4非極性表達(dá)部位,AQP4與p-DG仍然呈明顯的共表達(dá)。ICH后1 d、3 d、7 d的血腫周圍組織中,β-DG蛋白含量明顯降低,與sham組比較,差值具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。ICH后1 d、3d、7d的血腫周圍組織中,β-DG mRNA含量無明顯變化,與sham組比較,差值不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.自體血注入后,ICH腦組織中存在水平衡紊亂,并且本模型所誘導(dǎo)的出血性腦水腫主要為血管源性腦水腫；2.血腫周圍組織中AQP4表達(dá)增強(qiáng),但其主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體上,而非極性表達(dá)到星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上,即ICH后腦組織中,AQP4極性表達(dá)缺失；3.ICH后腦組織中,伴隨著AQP4的極性表達(dá)缺失,β-DG表達(dá)下調(diào),提示p-DG表達(dá)下調(diào)與AQP4極性表達(dá)缺失密切相關(guān)；4.AQP4極性表達(dá)缺失具有重要的病理生理意義。β-DG表達(dá)下調(diào)后,AQP4難于通過p-DG與細(xì)胞外基質(zhì)連接,從而不能極性定位到星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上；血腫周圍組織中,由于血凝塊回縮血漿滲出,以及毛細(xì)血管通透性增加,血管內(nèi)容物滲出等原因,大量水分積聚到細(xì)胞外間隙,但此時血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上的極性表達(dá)的AQP4明顯降低,不能及時有效的將細(xì)胞外間隙的水分快速轉(zhuǎn)運進(jìn)毛細(xì)血管,從而延緩了水腫的清除。即AQP4極性表達(dá)缺失可能一定程度上促進(jìn)了出血性腦水腫的發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：腦出血 腦水腫 水通道蛋白 極性表達(dá) β-dystroglycan
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.34
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-23
• 參考文獻(xiàn)20-23
• 第一部分：AQP4在腦出血腦組織中表達(dá)變化的研究23-71
• 1 材料與方法23-30
• 2 實驗方法30-40
• 3 結(jié)果40-45
• 4 討論45-52
• 5 小結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-61
• 附圖61-71
• 第二部分 β-DG對AQP4極性表達(dá)變化的影響71-102
• 1 材料與方法71-77
• 2 方法77-84
• 3 結(jié)果84-85
• 4 討論85-89
• 5 小結(jié)89-91
• 參考文獻(xiàn)91-94
• 附圖94-102
• 全文小結(jié)102-103
• 文獻(xiàn)綜述103-115
• 參考文獻(xiàn)109-115
• 致謝115-116
• 攻讀博士學(xué)位期間撰寫、發(fā)表的學(xué)術(shù)論文116-117

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本文編號：624429