本文關鍵詞：地五養(yǎng)肝膠囊對Solt-Farber二步法肝癌大鼠模型的肝癌發(fā)生發(fā)展的影響及其機制

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【摘要】：目的:研究基于骨髓干細胞轉化肝癌干細胞的肝癌發(fā)生發(fā)展機制,闡明體現(xiàn)“補腎生髓成肝”治療法則的地五養(yǎng)肝膠囊對肝癌發(fā)生發(fā)展的影響及其機制,豐富“肝主生發(fā)”(“髓生肝”、“髓失生肝”、“補腎生髓成肝”)的科學內(nèi)涵。方法:(1)80只4-5周齡的雄性SPF級SD大鼠,按隨機數(shù)字法分為模型組(Model)、索拉非尼組(Sorafenib)、地五養(yǎng)肝治療組(DWYG)、細胞對照組(BMSC)、空白對照組(Normal),每組16只。室內(nèi)清潔消毒后,加飼料及水適應性飼養(yǎng)1周后開始造模,用Solt-Farber二步法建立肝癌大鼠模型,具體方法如下:即造模第一天,模型組、索拉非尼組、地五養(yǎng)肝治療組按50mg/kg的劑量一次性腹腔注射(Intraperitoneal,ip)二乙基亞硝胺(Diethylmitrosamine,DEN)作為啟動劑,2周后均按15mg/kg/d劑量予以二乙酰氨基芴(2-Acetylaminofluorene,2-AAF)灌胃(Intragastrical administration,ig)7天,第3周末行2/3肝部分切除術(Partial hepatectomy,PHx),切除肝左葉和中葉,并將紅色熒光蛋白標記的骨髓干細胞(Red fluorescent protein-bone stem cells,RFP-BMSCs)種植于大鼠肝右葉的12點、3點、6點、9點和中心點位置,每個點注射0.1ml RFP-BMSCs(約105個細胞),分層縫合。細胞對照組不做肝切除術僅移植RFP-BMSCs于大鼠肝右葉。地五養(yǎng)肝治療組于造模期間按750mg/kg/d劑量給予地五養(yǎng)肝膠囊水溶液(DWYG)灌胃,索拉非尼組按80mg/kg/d劑量給予索拉非尼溶液(Sorafenib)灌胃,模型組、細胞對照組、空白對照組則給予等量生理鹽水(Normal saline)灌胃對照。手術4天起給予對應的藥物灌胃16周。即模型組(DEN ip+2-AAF ig+PHx+RFP-BMSCs+NS ig)、索拉非尼組(DEN ip+2-AAF ig+PHx+RFP-BMSCs+Sorafenib ig)、地五養(yǎng)肝治療組(DEN ip+2-AAF ig+PHx+RFP-BMSCs+DWYG ig)、細胞對照組(NS ip+RFP-BMSCs+NS ig)、空白對照組(NS ip+NS ig)。實驗結束后處死各組實驗大鼠,切取實驗大鼠肝組織以4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋,做厚5μm的連續(xù)切片,蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosinstaining,he)進行組織病理學檢測,并于每組內(nèi)每張切片隨機挑選3-4個400倍視野,采用記分法進行半定量分析評估每個視野中肝癌的病理程度。根據(jù)edmondson-steiner分級標準和陽性細胞百分比分別計分,以各組平均積分分析不同組中大鼠肝癌病理程度。切取實驗大鼠肝組織以carnoy’s固定液固定(無水乙醇:冰乙酸=3:l)做厚5μm的連續(xù)切片,feulgen染色進行肝細胞核dna含量檢測。免疫組織化學染色法以檢測肝組織pcna、abcg2、cd34、thy-1的表達。采用免疫熒光法檢測肝組織中骨髓干細胞和肝癌干細胞相關標志物abcg2/cd34、abcg2/cd45、abcg2/thy-1的表達。切取大鼠肝組織以液氮凍存。蛋白印跡雜交技術(westernblot)檢測肝組織中emt相關e-cadherin、vimentin、tgf-β1的表達,檢測ras/raf/mek/erk、jak/stat信號通路相關蛋白的表達。逆轉錄聚合酶鏈式反應(reversetranscription-polymerasechainreaction,rt-pcr)檢測e-cadherin、vimentin、ras/raf/mek/erk、jak/stat信號通路相關mrna的表達。所有數(shù)據(jù)均采用spss19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,結果均以mean±sd(均數(shù)土標準差)表示。多組之間比較采用單因素方差分析(one-wayanova),p0.05被認為有統(tǒng)計學意義。結果:1肉眼觀察肝臟大體形態(tài):空白對照組肝臟形態(tài)正常,表面光滑,邊緣銳利,質(zhì)軟。模型組和空白對照組比較,可見肝臟形態(tài)不規(guī)則,肝葉不全,表面粗糙,凸凹不平,質(zhì)地較硬,表面和切面呈彌漫性肝結節(jié),大小不等,或可見出血、壞死等特征。經(jīng)索拉非尼、地五養(yǎng)肝膠囊治療后上述病理表現(xiàn)明顯減輕。2組織病理學結果(he染色):空白對照組肝細胞結構基本正常,排列整齊,胞膜完整,胞核清晰。模型組和空白對照組比較,可見腫瘤細胞生長旺盛,細胞密度大,肝細胞索排列紊亂,核質(zhì)比大,核染色深,或核異型,伴炎性細胞浸潤等病理特征。和模型組比較,經(jīng)索拉非尼、地五養(yǎng)肝膠囊治療后上述病理變化明顯減輕。細胞對照組部分可見炎性細胞小灶。采用記分法半定量分析各組大鼠肝癌病理程度,結果顯示:模型組的平均積分(10.90±2.71)明顯高于空白對照組(0.00±0.00),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組的平均積分(8.00±2.43)低于模型組(10.90±2.71),差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);索拉非尼組的平均積分(8.20±3.11)亦低于模型組(10.90±2.71),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(8.00±2.43)和索拉非尼組(8.20±3.11)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。3地五養(yǎng)肝膠囊對肝細胞核dna含量的影響(feulgen染色法):模型組(14297.24±620.84)iod值明顯高于空白對照組(2901.33±84.64),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(8554.73±135.86)iod值低于模型組(14297.24±620.84),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);索拉非尼組(8965.99±338.65)iod值亦低于模型組(14297.24±620.84),p0.05;地五養(yǎng)肝治療組(8554.73±135.86)iod值低于索拉非尼組(8965.99±338.65),差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(2901.33±84.64)和細胞對照組(3346.42±181.37)比較,無統(tǒng)計學意義(p0.05)。4地五養(yǎng)肝膠囊對pcna(proliferatingcellnuclearantigen,增殖細胞核抗原)表達的影響(免疫組織化學法):模型組(0.5790±0.0303)od值明顯高于空白對照組(0.2821±0.0138),差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.4397±0.0181)od值明顯低于模型組(0.5790±0.0303),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);索拉非尼組(0.4553±0.0208)pcna的表達亦低于模型組(0.5790±0.0303),p0.05;地五養(yǎng)肝治療組(0.4397±0.0181)和索拉非尼組(0.4553±0.0208)之間,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.2821±0.0138)和細胞對照組(0.2934±0.0223)比較,無統(tǒng)計學意義(p0.05)。5地五養(yǎng)肝膠囊對肝癌干細胞的影響(1)地五養(yǎng)肝膠囊對骨髓干細胞和肝癌干細胞相關標志物abcg2、cd34、thy-1雙陽性表達的影響(免疫組織化學法):免疫組織化學染色對abcg2表達的檢測結果顯示:模型組abcg2的表達(0.3276±0.0210)明顯高于空白對照組(0.1930±0.0045),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.2423±0.0144)od值明顯低于模型組(0.3276±0.0210),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);索拉非尼組(0.2514±0.0203)abcg2的表達亦低于模型組(0.3276±0.0210),p0.05;地五養(yǎng)肝治療組(0.2423±0.0144)和索拉非尼組(0.2514±0.0203)之間,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.1930±0.0045)和細胞對照組(0.1964±0.0126)比較,無統(tǒng)計學意義(p0.05)。免疫組織化學染色對cd34表達的檢測結果顯示:模型組cd34的表達(0.5880±0.0290)明顯高于空白對照組(0.4077±0.0086),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.4857±0.0312)od值明顯低于模型組(0.5880±0.0290),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);索拉非尼組(0.4648±0.0239)cd34的表達亦低于模型組(0.5880±0.0290),p0.05;地五養(yǎng)肝治療組(0.4857±0.0312)和索拉非尼組(0.4648±0.0239)之間,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.4077±0.0086)和細胞對照組(0.3980±0.0098)比較,無統(tǒng)計學意義(p0.05)。免疫組織化學染色對thy-1表達的檢測結果顯示:模型組thy-1的表達(0.5887±0.0361)明顯高于空白對照組(0.4121±0.0134),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.4787±0.0228)od值明顯低于模型組(0.5887±0.0361),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);索拉非尼組(0.4790±0.0274)thy-1的表達亦低于模型組(0.5887±0.0361),p0.05;地五養(yǎng)肝治療組(0.4787±0.0228)和索拉非尼組(0.4790±0.0274)之間,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.4121±0.0134)和細胞對照組(0.4085±0.0220)比較,無統(tǒng)計學意義(p0.05)。(2)地五養(yǎng)肝膠囊對骨髓干細胞及肝癌干細胞相關標志物雙陽性表達的影響(免疫熒光法):模型組、索拉非尼組和地五養(yǎng)肝治療組中abcg2/cd34、abcg2/cd45、abcg2/thy-1呈雙陽性表達。模型組abcg2/cd34的雙陽性熒光表達(0.3136±0.0294)明顯高于空白對照組(0.1954±0.0110),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.2188±0.0114)abcg2/cd34的雙陽性表達明顯低于模型組(0.3136±0.0294),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);索拉非尼組(0.2359±0.0179)abcg2/cd34的雙陽性表達亦低于模型組(0.3136±0.0294),p0.05;地五養(yǎng)肝治療組(0.2188±0.0114)和索拉非尼組(0.2359±0.0179)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.1954±0.0110)和細胞對照組(0.1944±0.0066)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。模型組abcg2/cd45的雙陽性熒光表達(0.3089±0.0113)明顯高于空白對照組(0.1996±0.0104),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.2377±0.0163)abcg2/cd45的雙陽性表達明顯低于模型組(0.3089±0.0113),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);索拉非尼組(0.2328±0.0157)abcg2/cd34的雙陽性表達亦低于模型組(0.3089±0.0113),p0.05;地五養(yǎng)肝治療組(0.2377±0.0163)和索拉非尼組(0.2328±0.0157)之間,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.1996±0.0104)和細胞對照組(0.1891±0.0090)比較,無統(tǒng)計學意義(p0.05)。模型組abcg2/thy-1的雙陽性熒光表達(0.2953±0.0146)明顯高于空白對照組(0.1995±0.0082),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.2320±0.0148)abcg2/thy-1的雙陽性表達明顯低于模型組(0.2953±0.0146),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);索拉非尼組(0.2458±0.01360)abcg2/cd34的雙陽性表達亦低于模型組(0.2953±0.0146),p0.05;地五養(yǎng)肝治療組(0.2320±0.0148)和索拉非尼組(0.2458±0.01360)之間,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.1995±0.0082)和細胞對照組(0.1980±0.0076)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。6地五養(yǎng)肝膠囊對肝癌發(fā)生發(fā)展的機制相關指標的影響(1)地五養(yǎng)肝膠囊對emt相關指標的影響:westernblot檢測emt相關標志物結果顯示:模型組(0.35±0.03)的上皮細胞標志物e-cadherin蛋白表達明顯低于空白對照組(1.16±0.10),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.72±0.04)e-cadherin蛋白表達明顯高于模型組(0.35±0.03),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.72±0.04)和索拉非尼組(0.62±0.07)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(1.16±0.10)和細胞對照組(1.22±0.09)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。模型組間皮細胞標志物vimentin蛋白的表達(1.52±0.06)明顯高于空白對照組(0.36±0.03),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.93±0.08)vimentin蛋白的表達明顯低于模型組(1.52±0.06),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.93±0.08)和索拉非尼組(1.08±0.11)比較,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.36±0.03)和細胞對照組(0.33±0.01)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。模型組中對emt起重要調(diào)節(jié)作用的tgf-β1蛋白的表達(1.76±0.10)明顯高于空白對照組(0.43±0.04),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.93±0.05)tgf-β1蛋白的表達明顯低于模型組(1.76±0.10),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);細胞對照組(0.30±0.03)和空白對照組(0.43±0.04)比較,有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.93±0.05)和索拉非尼組(0.93±0.03)相比,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.43±0.04)和細胞對照組(0.30±0.03)比較,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。rt-pcr結果顯示:模型組的上皮細胞標志物e-cadherinmrna表達明顯低于空白對照組,經(jīng)統(tǒng)計學處理,差異顯著(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組e-cadherinmrna的表達明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);而間皮細胞標志物vimentinmrna表達明顯高于空白對照組,經(jīng)統(tǒng)計學處理,p0.05;地五養(yǎng)肝治療組vimentinmrna的表達明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組e-cadherin和vimentinmrna的表達與索拉非尼組比較,差異無統(tǒng)計學意義p0.05;空白對照組和細胞對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。(2)地五養(yǎng)肝膠囊對ras/raf/mek/erk通路相關指標的影響:westernblot結果顯示模型組raf-1(0.91±0.05)蛋白的表達明顯高于空白對照組(0.40±0.05),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.79±0.02)raf-1、蛋白表達明顯低于模型組(0.91±0.05),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.79±0.02)raf-1蛋白的表達與索拉非尼組(0.77±0.05)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.40±0.05)和細胞對照組(0.36±0.04)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。mek1(1.81±0.10)蛋白的表達明顯高于空白對照組(0.70±0.03),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(1.10±0.05)mek1蛋白表達明顯低于模型組(1.81±0.10),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組mek1蛋白(1.10±0.05)的表達低于索拉非尼組(1.25±0.05),p0.05;空白對照組(0.70±0.03)和細胞對照組(0.72±0.06)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。erk1(1.49±0.04)蛋白的表達明顯高于空白對照組(0.55±0.11),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.95±0.09)erk1蛋白表達明顯低于模型組(1.49±0.04),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(0.95±0.09)erk1蛋白的表達與索拉非尼組(0.98±0.08)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.55±0.11)和細胞對照組(0.53±0.12)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。模型組vegf(2.31±0.15)蛋白的表達明顯高于空白對照組(0.59±0.05),經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(1.76±0.24)vegf蛋白表達明顯低于模型組(2.31±0.15),具有統(tǒng)計學意義(p0.05);地五養(yǎng)肝治療組(1.76±0.24)vegf蛋白的表達與索拉非尼組(1.66±0.13)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.59±0.05)和細胞對照組(0.77±0.07)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。rt-pcr結果顯示:模型組raf-1、mek1、erk1mrna的表達明顯高于空白對照組,經(jīng)統(tǒng)計學處理,p0.05;與模型組比較,地五養(yǎng)肝治療組中raf-1、mek1、erk1mrna的表達均降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);索拉非尼組raf-1、mek1、erk1mrna表達亦低于模型組,p0.05;地五養(yǎng)肝治療組與索拉非尼組比較,差異無統(tǒng)計學意義;空白對照組和細胞對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。(3)地五養(yǎng)肝膠囊對jak/stat通路相關指標的影響:模型組(1.40±0.04)jak2蛋白的表達明顯高于空白對照組(0.47±0.03),經(jīng)統(tǒng)計學處理,p0.05。地五養(yǎng)肝治療組jak2的表達(1.01±0.05)顯著下調(diào),與模型組(1.40±0.04)比較,差異有統(tǒng)計學意義,p0.05;地五養(yǎng)肝治療組(1.01±0.05)jak2蛋白的表達與索拉非尼組(1.12±0.09)比較,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.47±0.03)和細胞對照組(0.49±0.04)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。模型組(1.27±0.09)stat3蛋白的表達明顯高于空白對照組(0.44±0.06),經(jīng)統(tǒng)計學處理,p0.05;地五養(yǎng)肝治療組stat3的表達(0.85±0.03)顯著下調(diào),與模型組(1.27±0.09)比較,差異有統(tǒng)計學意義,p0.05;地五養(yǎng)肝治療組(0.85±0.03)stat3蛋白的表達與索拉非尼組(0.96±0.08)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.44±0.06)和細胞對照組(0.40±0.09)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。模型組(1.58±0.04)stat5蛋白的表達明顯高于空白對照組(0.63±0.04),經(jīng)統(tǒng)計學處理,p0.05;地五養(yǎng)肝治療組stat5的表達(0.95±0.09)顯著下調(diào),與模型組(1.58±0.04)比較,差異有統(tǒng)計學意義,p0.05;地五養(yǎng)肝治療組(0.95±0.09)stat5蛋白的表達與索拉非尼組(1.10±0.15)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組(0.63±0.04)和細胞對照組(0.62±0.05)比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。rt-pcr結果顯示:模型組jak2、stat3的mrna表達明顯高于空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義,p0.05;地五養(yǎng)肝治療組jak2、stat3的表達顯著下調(diào),與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);索拉非尼組jak2、stat3mrna表達亦低于模型組,p0.05;地五養(yǎng)肝治療組jak2mrna表達低于索拉非尼組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);空白對照組和細胞對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論:1地五養(yǎng)肝膠囊在一定程度上抑制了solt-farber二步法肝癌大鼠模型的肝癌發(fā)生發(fā)展,其效果不低于索拉非尼。2骨髓干細胞轉化肝癌干細胞參與肝癌發(fā)生發(fā)展是“髓失生肝”的生物學基礎。骨髓干細胞轉化肝干細胞參與肝再生修復是“髓生肝”的生物學基礎。體現(xiàn)“補腎生髓成肝”治療法則的地五養(yǎng)肝膠囊具有抑制“髓失生肝”、促進“髓生肝”的作用。該研究豐富了“髓失生肝/髓生肝”的科學內(nèi)涵。3體現(xiàn)“補腎生髓成肝”治療法則的地五養(yǎng)肝膠囊通過改善肝再生的微環(huán)境從而延緩肝癌發(fā)生發(fā)展的進程,其可能作用機制如下:(1)抑制“髓失生肝”、促進“髓生肝”;(2)通過調(diào)控emt/met失衡,抑制emt,促進met;(3)通過調(diào)節(jié)jak/stat信號通路;(4)通過調(diào)節(jié)ras/raf/mek/erk信號通路。
【關鍵詞】：原發(fā)性肝癌 地五養(yǎng)肝膠囊 “髓失生肝” “補腎生髓成肝”
【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5;R-332
【目錄】：

• 中文摘要5-14
• ABSTRACT14-26
• 縮略詞表26-28
• 前言28-30
• 1 實驗材料30-33
• 1.1 儀器與設備30-31
• 1.2 實驗動物及細胞31
• 1.3 實驗試劑31-33
• 1.4 實驗藥物33
• 1.5 其它材料33
• 2 實驗方法33-44
• 2.1 建立Solt-Farber二步法肝癌大鼠模型33-35
• 2.2 組織病理學檢測肝癌病理程度35-37
• 2.3 Feulgen染色檢測肝組織細胞核DNA含量37
• 2.4 免疫組織化學染色法檢測PCNA、ABCG2、CD34、Thy-1 的表達37-38
• 2.5 免疫熒光檢測ABCG2/CD34、ABCG2/CD45及ABCG2/Thy-1 的表達38
• 2.6 Western Blot檢測EMT、Ras/Raf/Mek/Erk及JAK/STAT通路相關蛋白表達38-41
• 2.7 RT-PCR檢測EMT、Ras/Raf/Mek/Erk及JAK/STAT通路相關mRNA表達41-43
• 2.8 結果評估43-44
• 2.9 統(tǒng)計學處理44
• 3 實驗結果44-58
• 3.1 肉眼觀察肝臟大體形態(tài)44-45
• 3.2 地五養(yǎng)肝膠囊對肝癌病理程度的影響45
• 3.3 地五養(yǎng)肝膠囊對肝細胞核DNA含量的影響45-46
• 3.4 地五養(yǎng)肝膠囊對PCNA表達的影響(免疫組織化學法)46-48
• 3.5 地五養(yǎng)肝膠囊對肝癌干細胞的影響48-52
• 3.5.1 地五養(yǎng)肝膠囊對ABCG2、CD34、Thy-1 表達的影響(免疫組織化學法)48-49
• 3.5.2 地五養(yǎng)肝膠囊對骨髓干細胞及肝癌干細胞相關標志物雙陽性表達的影響(免疫熒光法)49-52
• 3.6 地五養(yǎng)肝膠囊對肝癌發(fā)生發(fā)展的機制相關指標的影響52-58
• 討論58-83
• 1 中醫(yī)藥防治肝癌的策略58-60
• 2 骨髓干細胞參與肝癌發(fā)生發(fā)展是“髓失生肝”的生物學基礎60-63
• 3 骨髓干細胞參與肝再生修復是“髓生肝”的生物學基礎63-65
• 4 地五養(yǎng)肝膠囊防治肝癌的療效機制65-68
• 5 地五養(yǎng)肝膠囊改善肝再生微環(huán)境影響肝癌發(fā)生發(fā)展的機制68-83
• 5.1 地五養(yǎng)肝膠囊調(diào)節(jié)“髓生肝/髓失生肝”失衡以抑制肝癌發(fā)生發(fā)展69-73
• 5.2 地五養(yǎng)肝膠囊調(diào)節(jié)EMT/MET失衡抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的作用73-78
• 5.3 地五養(yǎng)肝膠囊對Ras/Raf/Mek/Erk信號通路的調(diào)控作用78-80
• 5.4 地五養(yǎng)肝膠囊對JAK/STAT信號通路的調(diào)控作用80-83
• 結語83-84
• 參考文獻84-98
• 附錄1綜述98-109
• 參考文獻103-109
• 附錄2博士生期間發(fā)表文章109-110
• 致謝110

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本文編號：554893