本文關(guān)鍵詞：miR-133b對(duì)軸突生長的調(diào)控作用及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： miR-133b RhoA PC12細(xì)胞 神經(jīng)元 軸突生長

【摘要】：腦、脊髓等CNS(central nerve system,中樞神經(jīng)系統(tǒng))損傷后可遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙,威脅人類健康,影響人們生活質(zhì)量,并且目前尚無有效的治療方法。研究表明,腦、脊髓損傷后神經(jīng)傳導(dǎo)束無法再生是導(dǎo)致神經(jīng)功能難以恢復(fù)的重要因素之一。CNS損傷后局部環(huán)境中存在神經(jīng)元軸突生長抑制物,包括Nogo-A、MAG(myelin-associated glycoprotein,髓磷脂相關(guān)糖蛋白)和星形細(xì)胞分泌的CSPG(Chondroitin sulphate proteoglycans,硫酸軟骨素蛋白多糖)。這些抑制分子與軸突頂端的生長錐接觸后,可與神經(jīng)元細(xì)胞膜上的Nogo受體等結(jié)合后激活Rho隨后活化Rho相關(guān)激酶(Rho-associated kinase,ROCK),導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,繼而引起生長錐塌陷、回縮,神經(jīng)軸突停止生長。MicroRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA,能夠識(shí)別其靶基因3’UTR區(qū)的互補(bǔ)位點(diǎn)并與之結(jié)合,通過轉(zhuǎn)錄后途徑調(diào)控靶基因蛋白的表達(dá),其在CNS發(fā)育過程中具有重要作用。最近,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在神經(jīng)細(xì)胞軸突生長、分叉、導(dǎo)向和再生中也扮演重要角色,比如miR-34a可調(diào)控小鼠軸突生長和脊髓形態(tài)、功能,miR-124a與軸突分叉密切相關(guān),而lin-4 mi RNA等則與神經(jīng)軸突導(dǎo)向、靶細(xì)胞定位等相關(guān)。研究報(bào)道m(xù)iR-133b在多種腫瘤組織中差異表達(dá),包括前列腺癌、肺癌和消化道腫瘤。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,miR-133b在人類及小鼠的中腦組織中表達(dá)增高,并且能夠通過調(diào)控靶基因Pitx3的表達(dá)在中腦多巴胺神經(jīng)元的分化中起重要作用。另外Yu等人發(fā)現(xiàn)miR-133b與脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)有關(guān),而且與卒中后功能恢復(fù)也密切相關(guān),但是miR-133b在神經(jīng)細(xì)胞中對(duì)于軸突生長的作用及相關(guān)機(jī)制尚未有研究,另外miR-133b是否與CNS損傷后軸突生長抑制分子對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)束再生的抑制作用相關(guān)亦無報(bào)道。目的:探討miR-133b對(duì)神經(jīng)細(xì)胞軸突生長的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。方法:第一部分:制備miR-133b過表達(dá)和miR-133b inhibitor以及相應(yīng)對(duì)照慢病毒,并通過gfp(greenfluorescentprotein,綠色熒光蛋白)表達(dá)量篩選最佳轉(zhuǎn)染效率。首先分別轉(zhuǎn)染mir-133b過表達(dá)和對(duì)照慢病毒,qrt-pcr方法檢測(cè)兩組細(xì)胞中mir-133b表達(dá)量,并進(jìn)一步分析兩組細(xì)胞軸突生長情況;其次通過mir-133binhibitor干擾細(xì)胞內(nèi)mir-133b表達(dá)并觀察其對(duì)軸突生長的影響;另外,利用tunel和mtt方法檢測(cè)mir-133b對(duì)pc12細(xì)胞凋亡和增殖的影響;最后利用ngf(nervegrowthfactor,神經(jīng)生長因子)進(jìn)一步探究mir-133b是否與神經(jīng)分化相關(guān)。第二部分:制備rhoa特異性sh-rna和rhoa過表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒。利用westernblot和qrt-pcr的方法檢測(cè)過表達(dá)或抑制mir-133b對(duì)rhoa蛋白及mrna表達(dá)的影響及相互關(guān)系。通過sh-rna抑制細(xì)胞內(nèi)rhoa蛋白表達(dá),進(jìn)一步研究rhoa蛋白對(duì)pc12細(xì)胞軸突生長的影響,最后通過補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mir-133b對(duì)促進(jìn)pc12細(xì)胞軸突生長的作用機(jī)制是否呈rhoa依賴性。第三部分:利用westernblot方法檢測(cè)mir-133b過表達(dá)是否能促進(jìn)某些軸突生長相關(guān)通路的激活(如mapk和pi3k/akt等);接著干擾細(xì)胞內(nèi)mir-133b觀察這些通路可否被抑制,另外利用通路特異性抑制劑抑制關(guān)鍵分子磷酸化驗(yàn)證mir-133b對(duì)軸突生長的調(diào)控是否是通路依賴性;最后利用sh-rna等技術(shù)觀察mir-133b靶基因的表達(dá)是否與這些通路的激活相關(guān)。第四部分:體外提取、培養(yǎng)、純化大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞,通過慢病毒調(diào)控神經(jīng)元內(nèi)mir-133b表達(dá),觀察其是否神經(jīng)元神經(jīng)軸突生長相關(guān)。另外利用cspg體外模擬cns損傷后對(duì)軸突生長的抑制作用,觀察mir-133b能否減弱軸突生長抑制因子對(duì)神經(jīng)軸突生長的抑制作用。結(jié)果:第一部分:在pc12細(xì)胞中,mir-133b調(diào)控其軸突的生長,過表達(dá)mir-133b促進(jìn)軸突生長,相反,下調(diào)pc12細(xì)胞中mir-133b表達(dá)抑制軸突生長,但是mir-133b不影響pc12細(xì)胞的神經(jīng)分化。第二部分:過表達(dá)mir-133b抑制pc12細(xì)胞中rhoa蛋白的表達(dá),但是對(duì)mRNA沒有影響。利用質(zhì)粒介導(dǎo)的shRNA干擾PC12細(xì)胞內(nèi)RhoA表達(dá)能夠模擬miR-133b對(duì)軸突生長的促進(jìn)作用,而共轉(zhuǎn)染RhoA質(zhì)粒和可消除miR-133b對(duì)PC12細(xì)胞軸突生長的促進(jìn)作用。第三部分:miR-133b的過表達(dá)促進(jìn)了ERK1/2和Akt絲氨酸473位點(diǎn)的磷酸化,但是對(duì)p38的磷酸化沒有影響,而且加入PI3K抑制劑LY294002和MAPK激酶MEK1抑制劑PD098059可以分別消除miR-133b對(duì)軸突生長的促進(jìn)作用。和過表達(dá)miR-133b類似,抑制RhoA蛋白的表達(dá)也促進(jìn)了ERK1/2和Akt(Ser473)的磷酸化。第四部分:在大鼠原代皮層神經(jīng)元中,過表達(dá)mi R-133b能夠通過抑制RhoA蛋白的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長;神經(jīng)軸突的生長在CSPG包被的培養(yǎng)皿中受到抑制,而miR-133b可以逆轉(zhuǎn)其抑制作用促進(jìn)軸突生長。結(jié)論:綜上所述,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-133b可以促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長,可能的機(jī)制是miR-133b抑制了神經(jīng)細(xì)胞中RhoA蛋白的表達(dá)和RhoA/ROCK信號(hào)通路,并減弱了CSPG對(duì)神經(jīng)軸突生長的抑制作用,同時(shí)激活了MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路,從而促進(jìn)了神經(jīng)軸突的生長。
【關(guān)鍵詞】：miR-133b RhoA PC12細(xì)胞 神經(jīng)元 軸突生長
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.2
【目錄】：

• 縮略詞5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-20
• 參考文獻(xiàn)15-20
• 第一部分 iR-133b調(diào)控PC12細(xì)胞軸突生長20-46
• 1 引言20-21
• 2 材料與方法21-33
• 3 結(jié)果33-39
• 4 討論39-40
• 5 參考文獻(xiàn)40-46
• 第二部分 iR-133b通過調(diào)節(jié)靶基因RhoA表達(dá)調(diào)控軸突生長46-64
• 1 引言46
• 2 材料與方法46-55
• 3 結(jié)果55-59
• 4 討論59-60
• 5 參考文獻(xiàn)60-64
• 第三部分 miR-133b通過MEK1/ERK和PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)軸突生長64-79
• 1 引言64
• 2 材料與方法64-70
• 3 結(jié)果70-74
• 4 討論74-75
• 5 參考文獻(xiàn)75-79
• 第四部分 miR-133b促進(jìn)原代神經(jīng)元軸突再生79-96
• 1 引言79-80
• 2 材料與方法80-86
• 3 結(jié)果86-90
• 4 討論90-91
• 5 參考文獻(xiàn)91-96
• 綜述96-123
• 參考文獻(xiàn)104-123
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況123-125
• 致謝125

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1 李夏;miR-133b在前列腺癌中的作用及分子機(jī)制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

2 陸曉誠;miR-133b對(duì)軸突生長的調(diào)控作用及其機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：553851