本文關(guān)鍵詞：選擇性脾酪氨酸激酶抑制劑P505-15與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究

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【摘要】：背景類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以對稱性、多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、進(jìn)行性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病,全身多發(fā)關(guān)節(jié)受累。RA是一種復(fù)雜的退行性疾病,其發(fā)病過程中涉及到大量炎性和非炎性細(xì)胞。RA可反復(fù)遷延多年,關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織過度增殖,形成血管翳,對關(guān)節(jié)軟骨、骨以及韌帶的造成漸進(jìn)性侵襲性破壞,最終將導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形及關(guān)節(jié)功能喪失,致重度殘疾,對人類健康的危害極大�；趯A的發(fā)病機(jī)制以及相關(guān)的細(xì)胞和分子的病理生理研究發(fā)現(xiàn),脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase, Sy k)在RA的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性的作用。Syk是一個下游信號傳導(dǎo)因子級聯(lián)反應(yīng)激活的主要調(diào)節(jié)酶,在自身抗體的產(chǎn)生過程中,以及在多種內(nèi)在免疫效應(yīng)因子的作用中,具有無可替代的中心作用。免疫細(xì)胞在RA的發(fā)病過程中,也發(fā)揮至關(guān)重要的作用,而Syk也是這些免疫細(xì)胞活化的中心環(huán)節(jié),在這些細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。Syk在RA發(fā)病及病情進(jìn)展中發(fā)揮著諸多重要作用,這使得Syk抑制劑成為RA治療的非常有前景的候選藥物。眾多制藥和生物技術(shù)公司對抑制劑表現(xiàn)出了濃厚的興趣。目前針對RA治療和其他一些適應(yīng)癥的許多Syk小分子抑制劑正處在不同研發(fā)階段。p505-15是一種新型的、高度選擇性Syk抑制劑,相對于其它一些小分子Syk抑制劑,p505-15還沒有被系統(tǒng)的深入研究過。目的通過分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)及動物實驗、體內(nèi)/體外實驗等多個方面,系統(tǒng)的探討p505-15對Syk抑制作用的高效性、高特異性,對CIA發(fā)病及病情發(fā)展的有效抑制。方法通過SUDHL4細(xì)胞株,利用蛋白印跡分析法檢測BCR介導(dǎo)的BLNK的磷酸化,測定Syk的活性；檢測BCR介導(dǎo)的Syk的磷酸化,測定Lyn的活性；驗證p505-15抑制Syk的特異性。人的全血在抗-BCR或PMA刺激后誘導(dǎo)SYK依賴的或非依賴的信號系統(tǒng)和B細(xì)胞的功能性活化,使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞活化程度驗證p505-15特異性抑制Syk依賴的白細(xì)胞信號系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和B細(xì)胞的激活。將口服p505-15給藥后的小鼠血液通過磷酸化流式細(xì)胞儀測量Syk活性驗證p505-15在體內(nèi)抑制Syk的高效性及可逆性。建立小鼠CIA模型,通過CIA小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分、后踝關(guān)節(jié)腫脹程度以及CIA小鼠關(guān)節(jié)組織HE染色切片觀察關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)變化、番紅O關(guān)節(jié)軟骨染色、關(guān)節(jié)滑膜組織巨噬細(xì)胞浸潤,并使用免疫組化方法測定血清抗-CⅡ IgG1和IgG2a及血清TNF-α、IL-6和IL-17水平等方法驗證p505-15抑制CIA小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病、發(fā)展及相關(guān)炎性因子的產(chǎn)生。通過獲取分離培養(yǎng)的原代人RA滑膜細(xì)胞,檢測其分泌TNF-α, IL-6和IL-17的水平,驗證p505-15可抑制人RA促炎性反應(yīng)從而削弱自身免疫性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。結(jié)果1、在S UDHL4細(xì)胞株,各不同濃度的p505-15均抑制了BLNK Tyr84的磷酸化,提示Syk活性得到抑制,并顯示了明顯的濃度依賴性；而Lyn活性在試驗中的各種p505-15濃度下均沒有觀察到相應(yīng)的抑制。Syk半數(shù)最大抑制所需要的p505-15濃度在0.16-0.4uM之間。2、在人的全血中,p505-15抑制了Syk信號系統(tǒng)介導(dǎo)的ERK Tyr204的磷酸化(pERK Tyr204;均值IC50±EM,0.27um±0.02)和白細(xì)胞的激活(CD69；均值IC50±SEM,0.28um±0.03),但沒有抑制Lyn依賴的信號系統(tǒng)介導(dǎo)的Syk Y352的磷酸化(pSyk Y352).3、小鼠予以p505-15 15mg/kg bid的口服劑量后,給藥2小時至6小時期間觀察到Syk的活性被抑制超過50%,其中在服藥后3小時Syk的活性抑制最大,為80%左右；6小時以后Syk活性逐漸恢復(fù),至24小時Syk活性恢復(fù)至80%以上。在整個實驗過程中沒有觀察到Lyn活性抑制。4、成功獲取小鼠CIA模型,小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分在第28-30天時急劇升高,之后趨于平緩,于實驗的第36天基本達(dá)到頂峰,AI最高計分為9.2±0.7。CIA小鼠后踝關(guān)節(jié)最腫脹處厚度均隨時間延長而增加,至第32天時趨于平緩,于初次免疫后第36天達(dá)到頂峰,最高值為42±2%。口服p505-15的小鼠較口服賦形劑的空白對照組小鼠的足爪紅腫程度明顯減輕,關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低。足爪腫脹最大減輕20%,AI值最大降低3.4,統(tǒng)計學(xué)顯示P0.01。5、HE染色顯示口服賦形劑的空白對照組CIA小鼠的關(guān)節(jié)有明顯的慢性滑膜炎,關(guān)節(jié)及滑膜層增生,滑膜翳形成,關(guān)節(jié)內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤和纖維蛋白形成,周圍基質(zhì)中的原始中性粒細(xì)胞浸潤；在口服p505-15的治療組CIA小鼠的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)基本完好,炎性細(xì)胞浸潤和骨侵蝕明顯被抑制。HE染色骨侵蝕組織學(xué)評分顯示口服賦形劑的空白對照組CIA小鼠評分為2.9±0.4,口服p505-15的治療組CIA小鼠評分為1±0.1,統(tǒng)計學(xué)顯示P0.01,表明具有顯著性差異。6、番紅O染色顯示口服賦形劑的空白對照CIA小鼠的關(guān)節(jié)表現(xiàn)出明顯的軟骨破壞,關(guān)節(jié)內(nèi)的透明軟骨表面不規(guī)則,提示軟骨缺失,軟骨潮線的缺失和軟骨細(xì)胞固縮；而在口服p505-15治療組的CIA小鼠這一現(xiàn)象明顯減輕,相當(dāng)于正常透明軟骨的各級透明軟骨顯示清晰。關(guān)節(jié)軟骨侵蝕組織學(xué)評分顯示,口服賦形劑的空白對照CIA小鼠評分為2.7±0.2,口服p505-15治療組的CIA小鼠評分為1.3±0.1,P0.01表明具有顯著性差異。7、免疫組化分析滑膜組織切片中CD68的表達(dá)檢測滑液的巨噬細(xì)胞浸潤顯示在口服p505-15的治療組CIA小鼠的切片CD68表達(dá)較賦形劑的空白對照組CIA小鼠明顯降低。CD68評分分別為0.8±0.1和3.1±0.3,P0.01,表明具有顯著性差異。8、免疫組化方法測定血清抗-CⅡ IgG1和IgG2a,結(jié)果顯示與口服賦形劑的空白對照組CIA小鼠相比較,口服p505-15的治療組CIA小鼠所有的抗-CII抗體皆有顯著的降低,統(tǒng)計學(xué)顯示p0.01,表明具有顯著性差異。9、使用免疫組化方法予以測定血清TNF-α、IL-6和IL-17水平顯示口服p505-15小鼠的三種炎性因子水平有顯著下降,統(tǒng)計學(xué)顯示p0.01,表明具有顯著性差異。10、獲取分離培養(yǎng)的原代人RA滑膜細(xì)胞,使用2Ong/ml IL-1β處理后取上清液行示p505-15處理顯著的降低了TNF-a,TNF-α, IL-6IL-6和IL-17水平IL-17測定。數(shù)據(jù)顯,提示p505-15抑制促炎性反應(yīng)。結(jié)論Syk是許多免疫系統(tǒng)的疾病的重要的治療靶點。p505-15是高度特異性的和有效的小分子抑制劑,細(xì)胞實驗和體內(nèi)實驗均顯示Syk具有強(qiáng)效的免疫調(diào)節(jié)活性。在控制炎癥性疾病的免疫功能,使用p505-15對Syk的特異性抑制是一個有效的且安全可靠的可選方案。
【關(guān)鍵詞】：脾酪氨酸激酶 抑制劑 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 膠原誘導(dǎo)性小鼠關(guān)節(jié)炎
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 符號說明14-16
• 第一部分 前言16-20
• 第二部分 材料與方法20-43
• 第三部分 結(jié)果43-47
• 第四部分 討論47-50
• 第五部分 結(jié)論50-51
• 附圖51-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 致謝68-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文69-70
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況70-71
• 英文論文(一)71-116
• 英文論文(二)116-131

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張玲玲;魏偉;汪慶童;陳鏡宇;陳尹;吳華勛;;芍藥苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)信號的調(diào)節(jié)作用[J];中國藥理學(xué)通報;2008年03期

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本文編號：543349