本文關(guān)鍵詞：狂犬疫苗糖蛋白及乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標(biāo)記時(shí)間分辨免疫分析試劑的研制

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【摘要】：研究背景及目的狂犬病是世界性流行性疾病,是致命但可預(yù)防的人畜共患疾病,可導(dǎo)致嚴(yán)重衛(wèi)生問(wèn)題。該病是由狂犬病毒(Rabies Virus, RV)引起的人獸共患急性傳染病,人和溫血?jiǎng)游镆赘?犬是本病毒的敏感宿主和貯存宿主之一,在狂犬病的傳播過(guò)程中起主要作用�？袢≈饕ㄟ^(guò)動(dòng)物咬傷后,唾液中的狂犬病毒經(jīng)破損皮膚或粘膜侵入體內(nèi),在局部組織的神經(jīng)節(jié)繁殖,并進(jìn)一步侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng),最終擴(kuò)散至外周神經(jīng)和唾液腺而致病�？袢《驹谝吧鷦�(dòng)物或圈養(yǎng)動(dòng)物種群中傳播,持續(xù)威脅著暴露在患有狂犬病的動(dòng)物中的人類�？袢“l(fā)生在超過(guò)150個(gè)國(guó)家和地區(qū)。亞洲,據(jù)估計(jì)占全球55000狂犬病死亡病例的56%,每年有31000人死亡,而大多數(shù)是兒童。這是一個(gè)非常沉重的代價(jià)。我國(guó)是世界上受狂犬病危害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一,狂犬病發(fā)病率排名世界第二。預(yù)防和接觸后治療需要安全有效的疫苗。接種疫苗預(yù)防狂犬病的高危人群、暴露前免疫、暴露后預(yù)防性治療和預(yù)防寵物動(dòng)物被認(rèn)為是最可行和最重要的方法之一。每年,全世界超過(guò)1500萬(wàn)人獲得接觸后接種疫苗防止狂犬病,這可以每年預(yù)防成千上萬(wàn)的狂犬病死亡病例�？袢〔《緦儆趶棤畈《究�,狂犬病病毒屬,形態(tài)呈子彈狀,長(zhǎng)180nm,直徑75 nm,其頭部為半球形,末端常為平端,病毒顆粒由外殼和核心兩部分組成。其基因組由11928-11932個(gè)核苷酸組成,為單鏈、不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA,含5個(gè)大的開放閱讀框,編碼5種結(jié)構(gòu)蛋自�；蚪M從3’端至5’端的排列順序?yàn)镹、P、M、G和L基因,分別編碼病毒核蛋白(nucleoprotein, NP)、磷蛋白(phosphoprotein, NS)、膜基質(zhì)蛋白(matrix protein,MP)、糖蛋白(glycoprotein, GP)和轉(zhuǎn)錄大蛋白(polymerase, LP)。糖蛋白是狂犬病毒中唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原,其抗原性的保持主要依賴于其空間構(gòu)象�？袢《咎堑鞍椎慕Y(jié)構(gòu)特點(diǎn)與其抗原性和免疫原性密切相關(guān),它在刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。糖蛋白是狂犬病毒的主要保護(hù)性抗原。具有B、T細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn),能夠誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,刺激機(jī)體分泌中和抗體。糖蛋白含量是狂犬病疫苗的主要質(zhì)量指標(biāo),在狂犬病疫苗的研制過(guò)程中常需要及時(shí)進(jìn)行抗原含量的檢測(cè),目前用于狂犬病毒疫苗效力評(píng)價(jià)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)是美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)的方法。多年來(lái)我國(guó)也一直采用NIH法來(lái)測(cè)定�？袢∫呙缡褂肗IH動(dòng)物法測(cè)定存在成本昂貴、檢測(cè)周期長(zhǎng)、繁瑣和涉及到使用活狂犬病毒的安全問(wèn)題,以及受到國(guó)際動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的制約,因此不適用于疫苗生產(chǎn)過(guò)程中各步驟的監(jiān)測(cè)。因?yàn)榭袢〔《咎堑鞍椎暮勘砻饕呙绲男Я?在單克隆抗體可以正確識(shí)別折疊糖蛋白的條件下,可以采用免疫檢測(cè)方法定量糖蛋白含量,進(jìn)而判定疫苗效價(jià)。已經(jīng)有不少基于使用特定單克隆抗體對(duì)狂犬病病毒糖蛋白進(jìn)行測(cè)定的研究報(bào)道：IFA法、EIA、雙抗體夾心ELISA法等。因此,尋求更可靠、精確和快速的體外定量檢測(cè)狂犬病毒疫苗糖蛋白含量的檢測(cè)方法來(lái)替代NIH法勢(shì)在必行。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染的是誘發(fā)急性和慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主要原因之一。乙肝表面抗原(Hpatitis B surface antigen, HBsAg)是第一個(gè)可以在絲狀或球形表面抗原顆粒并在復(fù)制的循環(huán)過(guò)程中被檢測(cè)的病毒標(biāo)志物。檢測(cè)乙肝表面抗原量約為完整的病毒顆粒數(shù)量的1000倍。乙肝表面抗原可用測(cè)定技術(shù)在臨床肝炎發(fā)展出現(xiàn)6到8周后檢測(cè)到。此外,乙肝表面抗原在患者血清的數(shù)量遠(yuǎn)超過(guò)乙型肝炎病毒完整病毒粒子,并有強(qiáng)烈的免疫原性。HBsAg的檢測(cè)是在大多數(shù)其他血清學(xué)標(biāo)志物可能無(wú)法檢測(cè)的情況下評(píng)估急性或慢性乙型肝炎病毒感染最重要的方法。HBsAg檢測(cè)的另一個(gè)重要用途是篩查獻(xiàn)血者的血液制品來(lái)排除乙肝病毒感染。肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)被認(rèn)為是第五個(gè)最常見的癌癥和第三世界廣泛的癌癥相關(guān)死亡最常見的原因。由于全球大流行的乙肝和丙肝病毒感染,肝癌的發(fā)病率在亞洲和西方國(guó)家迅速增加,這一趨勢(shì)將持續(xù)未來(lái)50年由于長(zhǎng)期感染之間的延遲和肝細(xì)胞癌的發(fā)展。更重要的是,一些早期的肝癌患者往往無(wú)臨床癥狀,這往往導(dǎo)致診斷的延誤和高死亡率。肝癌的主要標(biāo)志物是甲胎蛋白,是單一多肽鏈糖蛋白,它是特定的肝癌標(biāo)志物并廣泛用于肝細(xì)胞癌的診斷。使用甲胎蛋白對(duì)肝癌的早期檢測(cè)是非�？扇『椭匾摹，F(xiàn)在,甲胎蛋白已經(jīng)被用于篩查肝癌在高風(fēng)險(xiǎn)但無(wú)臨床癥狀的患者,特別是早期可以治愈的腫瘤,可以減少疾病相關(guān)死亡率和改善生存和成本效益,這些優(yōu)勢(shì)使甲胎蛋白具有非常重要的臨床意義。但由于晚期的肝細(xì)胞癌的預(yù)后仍然很悲觀,因此新的治療方案和診斷策略的開發(fā)迫在眉睫。目前已經(jīng)有不少有關(guān)于甲胎蛋白和乙肝表面抗原免疫測(cè)定方法的報(bào)道。然而,所有這些都是檢測(cè)一個(gè)分析物而不是檢測(cè)擁有彼此互相關(guān)聯(lián)多個(gè)生物標(biāo)志物。甲胎蛋白和乙肝表面抗原如果可以在相同的單一分析進(jìn)行測(cè)定,整個(gè)過(guò)程將變得簡(jiǎn)單,并縮短了檢測(cè)時(shí)間。同時(shí)檢測(cè)甲胎蛋白和乙肝表面抗原可以獲得更多相關(guān)數(shù)據(jù),幫助臨床醫(yī)生監(jiān)控從慢性乙型肝炎到肝癌的整個(gè)轉(zhuǎn)換過(guò)程和肝細(xì)胞癌的預(yù)后評(píng)估。雙標(biāo)記已經(jīng)在各領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用。然而,傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記在多個(gè)分析物測(cè)定上有很大的局限性,就是很難區(qū)別各個(gè)標(biāo)志物的發(fā)射光區(qū)域。因此臨床上也迫切需求開發(fā)一個(gè)快速、適合和簡(jiǎn)便的甲胎蛋白和乙肝表面抗原雙標(biāo)記免疫分析技術(shù)。標(biāo)記免疫學(xué),就是將標(biāo)記技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行分析測(cè)定的一門學(xué)科,是集基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)技術(shù)和臨床應(yīng)用于一體的學(xué)科,其基本原理是利用抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和各標(biāo)記物的高靈敏可測(cè)量性來(lái)檢查各種生物活性物質(zhì)的活性和濃度。隨著標(biāo)記技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善,標(biāo)記免疫學(xué)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境及食品檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。目前該方法包括一系列的免疫分析技術(shù)：熒光免疫分析(Fluoroimmunoassay,FIA)、放射免疫分析(Radioimmunoassay, RIA)、酶免疫分析(Enzymatic immunoassay, EIA)、膠體金免疫分析(Gold immunochromatographic assay, GICA)、時(shí)間分辨熒光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)等。時(shí)間分辨熒光免疫分析是一種靈敏的高端定量免疫檢測(cè)技術(shù),是以鑭系稀土離子作為標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗原或抗體,因鑭系稀土離子具有獨(dú)特的熒光特性,該技術(shù)能夠獲得極高的信噪比,從而具有很高的靈敏度(10-18mol/孔),且具有標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)放射性污染、檢測(cè)重復(fù)性好、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、操作流程短、易自動(dòng)化、不受樣品自然熒光干擾、多標(biāo)記和應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點(diǎn)。因此,時(shí)間分辨熒光免疫分析相對(duì)于酶免分析、放射免疫分析以及膠體金分析法有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值。TRFIA技術(shù)適用于各種抗原抗體的臨床檢測(cè),在市場(chǎng)上已得到廣泛應(yīng)用。本研究采用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)研制狂犬病毒糖蛋白及甲胎蛋白和乙肝表面抗原的雙標(biāo)記定量檢測(cè)試劑,評(píng)價(jià)各項(xiàng)性能指標(biāo),并與其它檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)其在臨床檢測(cè)應(yīng)用中的可行性。方法：采用雙抗體夾心法研制狂犬疫苗糖蛋白及甲胎蛋白和乙肝表面抗原雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑。一、人用狂犬疫苗糖蛋白定量檢測(cè)試劑的研制與應(yīng)用1.狂犬病毒糖蛋白抗原的制備：根據(jù)狂犬病毒CTN株G基因膜外序列設(shè)計(jì)引物,提取狂犬病毒CTN株總RNA,采用AMV酶逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,利用PCR的方法從cDNA中擴(kuò)增G基因,將該基因片段定向克隆到原核表達(dá)載體p ET32a(+)中,構(gòu)建原核表達(dá)載體p ET32a/G。陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主菌BL21(DE3),用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并確定表達(dá)G基因的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。SDS-PAGE和Western-blo討表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和分析。2.人用狂犬病毒抗糖蛋白單克隆抗體的制備：以狂犬疫苗制劑為抗原免疫Bal/C小鼠,效價(jià)達(dá)到1：64000后,采用雜交瘤融合的方法制備單克隆抗體,使用狂犬病毒原液、人血清白蛋白及狂犬病毒核蛋白進(jìn)行篩選對(duì)抗體進(jìn)行初步篩選,篩出48株疑似糖蛋白單抗。3.單克隆抗體的純化：用Protein G Sepharose 4 Fast flow親和層析柱純化,并用BCA試劑盒測(cè)抗體濃度。4.銪標(biāo)記抗體與純化：超濾管純化抗體后,按質(zhì)量比5：1與銪標(biāo)記試劑充分混勻,25℃振蕩過(guò)夜,次日過(guò)SephadexTM G-50凝膠層析柱純化,同時(shí)收集流出液(1m1/管),收集液逐管取樣測(cè)量熒光信號(hào)值,合并信號(hào)峰值的收集管,加10%BSA保護(hù)劑,—20℃保存。5.特異性糖蛋白抗體的篩選及配對(duì)：先用狂犬病毒原液作為雙抗夾心的標(biāo)準(zhǔn)品,將48株抗糖蛋白單抗逐一包被,與另外47株銪標(biāo)抗體配對(duì),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,篩出配較佳的配對(duì)組合,再用自制糖蛋白抗原和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)品,從中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,最終篩出配對(duì)得上的單抗。6.參考標(biāo)準(zhǔn)品的配備用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液將糖蛋白抗原配制成0、31.25、62.5、125、250和250 mEu/L系列參考標(biāo)準(zhǔn)溶液,每瓶1 m1分裝凍干4℃保存?zhèn)溆谩?.試劑性能指標(biāo)的評(píng)價(jià)7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以自制試劑中參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),信號(hào)值對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理,繪圖軟件為OriginPro7.5 SR1 (Microcal, USA)。7.2靈敏度實(shí)驗(yàn)：將零值參考標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品測(cè)量20次,計(jì)算其均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以其測(cè)定值的均值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差所得信號(hào)值減去本底信號(hào)值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得出的濃度,即為分析靈敏度。7.3 Hook效應(yīng)：對(duì)濃度遞增的多個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)品抗原進(jìn)行測(cè)定。7.4準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：以自制參考品為對(duì)照品,并以自制參考品的實(shí)測(cè)濃度與標(biāo)示濃度的比值在0.90-1.10之間作為評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性合格的標(biāo)準(zhǔn)。7.5精密度實(shí)驗(yàn)：采用低、中、高3個(gè)質(zhì)控品(質(zhì)控品I、II、III)進(jìn)行測(cè)定,得到各質(zhì)控品檢測(cè)值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(CV)。7.6稀釋線性實(shí)驗(yàn)：已知的3個(gè)濃度的樣品使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液連續(xù)稀釋進(jìn)行平行度分析。7.7交叉反應(yīng)：通過(guò)檢測(cè)狂犬疫苗核蛋白來(lái)測(cè)定自制試劑的交叉反應(yīng)情況。7.8與NIH法測(cè)值的比較實(shí)驗(yàn)：樣本用自制試劑與NIH法所測(cè)濃度值進(jìn)行相關(guān)性分析。二、采用雙抗體夾心法研制乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫定量檢測(cè)分析試劑。1.用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將AFP抗原配制成系列濃度為：0 mIU/L、2 mIU/L 20 mIU/L、200 mIU/L、1000 mIU/L和2000 mIU/L;同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將HBsAg抗原配制成系列濃度為：0μg/L、0.4 μg/L、2 μg/L、10μg/L、50 μg/L和300 μg/L;再將兩種母液分別從低濃度到高濃度按1：1混勻,最后AFP (mIU/L)/HBsAg(μg/L)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為：0/0、1/0.2、10/1、100/5、500/25和1000/150；每瓶1ml分裝凍干,4℃保存?zhèn)溆谩?.固相包被抗體用包被液將AFP和HBsAg包被抗體稀釋后,一同加入96微孔板中包被,37℃震蕩2小時(shí)后,4℃過(guò)夜,37℃封閉3小時(shí),真空抽干,4℃保存。3.Eu3+標(biāo)記抗體制備超濾管純化抗體后,按質(zhì)量比5：1與銪標(biāo)記試劑充分混勻,25℃振蕩過(guò)夜,次日過(guò)SephadexTM G-50凝膠層析柱純化,同時(shí)收集流出液(1ml/管),逐管測(cè)量熒光信號(hào)值,合并峰管,加10%BSA保護(hù)劑,-20℃保存。4.Sm3+標(biāo)記抗體制備超濾管純化抗體后,按質(zhì)量比2：1與釤標(biāo)記試劑充分混勻,25℃振蕩過(guò)夜,次日過(guò)SephadexTM G-50凝膠層析柱純化,同時(shí)收集流出液(1ml/管),然后逐管測(cè)定熒光信號(hào)值,合并峰管,加入10%濃度的BSA作保護(hù)劑,—20℃保存。5.試劑性能指標(biāo)的評(píng)價(jià)5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以自制試劑中參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),信號(hào)值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理,繪圖軟件采用OriginPro7.5 SRI (Microcal, USA)。5.2靈敏度實(shí)驗(yàn)以零參考標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品測(cè)量20次,計(jì)算其均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以其測(cè)定值的均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差所得信號(hào)值再減去本底信號(hào)值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得出的濃度,即為其靈敏度。5.3準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)以自制參考品為對(duì)照品,計(jì)算試劑參考標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)濃度與標(biāo)示濃度的比值。5.4精密度實(shí)驗(yàn)精密度實(shí)驗(yàn)采用自制的低、中、高3個(gè)質(zhì)控品(質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)進(jìn)行測(cè)定,分析內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)設(shè)置復(fù)孔,分析間精密度實(shí)驗(yàn)設(shè)多次測(cè)定,計(jì)算各質(zhì)控品檢測(cè)值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及CV值。5.5稀釋線性實(shí)驗(yàn)使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液將已知濃度的血清樣本從1/2至1/32連續(xù)倍比稀釋進(jìn)行平行度分析。5.6干擾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)研發(fā)的分析試劑在干擾性物質(zhì)(溶血、高血脂、高膽紅素)存在的情況下檢測(cè)標(biāo)本的準(zhǔn)確性。按試劑操作說(shuō)明書對(duì)加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算其回收率。5.7與國(guó)外試劑的比較實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用自制試劑及雅培化學(xué)發(fā)光兩種試劑盒檢測(cè)血清樣本,使用統(tǒng)計(jì)軟件分析測(cè)值相關(guān)性。結(jié)果：一、成功從狂犬CTN株獲取目的基因,并構(gòu)建p ET32a/G重組質(zhì)粒,重組蛋白在BL21 (DE3)宿主菌中以包涵體的形式表達(dá),通過(guò)包涵體洗滌、Ni離子親和層析以及透析復(fù)性后抗體鑒定得到了純度較高的有活性的狂犬病毒糖蛋白抗原。采用單克隆抗體制備的經(jīng)典方案,以狂犬疫苗制劑免疫小鼠,取脾進(jìn)行細(xì)胞融合成功制備出48株疑似狂犬病毒糖蛋白單克隆抗體細(xì)胞株,進(jìn)一步采用糖蛋白抗原篩選出符合使用要求的特異性糖蛋白單克隆抗體配對(duì)組合(S036-S053EU3+)。并以特異性糖蛋白單克隆抗體配對(duì)組合(S036-S053EU3+)為基礎(chǔ)成功研制出狂犬疫苗糖蛋白時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑,自制試劑參考品實(shí)測(cè)濃度與標(biāo)示濃度的比值在0.90-1.10之間；靈敏度為0.098mEU/mL,在樣品濃度超過(guò)2000 mEU/mL將出現(xiàn)HOOK效應(yīng)；試劑分析內(nèi)變異系數(shù)和分析間變異系數(shù)均不超過(guò)10%；與狂犬核蛋白無(wú)交叉反應(yīng)；189份狂犬病毒樣品采用自制試劑和武漢病毒研究所糖蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒武漢進(jìn)行平行檢測(cè),對(duì)所測(cè)數(shù)值進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示兩種方法所得的數(shù)值相關(guān)性良好：Y=1.00X+1.38, R2=0.912, P0.0001；通過(guò)效力實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)做出糖蛋白濃度與參考疫苗和各樣品疫苗的線性關(guān)系,并計(jì)算出TRFIA所測(cè)得的疫苗效力值(T-NIH)。同時(shí)對(duì)TRFIA和NIH動(dòng)物法所測(cè)得的39份疫苗效力值進(jìn)行趨勢(shì)和相關(guān)性分析,結(jié)果兩種方法所得的數(shù)值趨勢(shì)一致,相關(guān)性良好：Y=0.930X+0.114, R2=0.903, P0.0001,兩種方法所測(cè)的數(shù)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),結(jié)果顯示：t0.05/2,38=-1.223, P=0.2290.05,表明兩種方法所測(cè)的數(shù)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二、自制乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫免疫分析試劑在檢測(cè)AFP和HBsAg的分析靈敏度分別為0.09 mIU/L和0.01 μg/L。檢測(cè)范圍分別為1-1000mIU/L和0.2-150 μg/L,在檢測(cè)AFP時(shí)分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)分別為3.3-4.1%和5.7-7.2%,而在檢測(cè)HBsAg時(shí)分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)分別為2.9-3.9%和4.9-6.8%。自制試劑臨床血清樣本測(cè)值同化學(xué)發(fā)光法測(cè)值相關(guān)性良好(R2AFP=0.989,P0.0001；R2HBsAg=0.988,P0.0001),兩種方法所測(cè)的數(shù)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),結(jié)果顯示：tAFP 0.05/2,111=-0.846,P=0.3990.05;tHBsAg 0.05/2,82=0.557,P=0.5790.05,可以認(rèn)為兩種方法所測(cè)數(shù)值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：上述結(jié)果表明本研究研制的狂犬疫苗糖蛋白及乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑的各項(xiàng)指標(biāo)(準(zhǔn)確性、靈敏度、精密度和抗干擾性等)均達(dá)到檢測(cè)試劑的使用要求,狂犬疫苗糖蛋白時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑疫苗樣品測(cè)值與NIH法測(cè)值有良好相關(guān)性,有望替代NIH動(dòng)物測(cè)定法用于疫苗生產(chǎn)的監(jiān)控及其有效性的鑒定。乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑有望替代國(guó)外昂貴試劑應(yīng)用于臨床檢測(cè)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究。
【關(guān)鍵詞】：時(shí)間分辨熒光免疫分析 狂犬疫苗糖蛋白 雙標(biāo)記 甲胎蛋白 乙肝表面 抗原
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-25
• 前言25-37
• 第一章 狂犬病毒糖蛋白抗原的制備37-50
• 1.1 材料37-40
• 1.2 方法40-42
• 1.3 結(jié)果42-48
• 1.4 討論48-49
• 1.5 結(jié)論49-50
• 第二章 狂犬疫苗糖蛋白抗體的篩選及配對(duì)50-67
• 2.1 材料50-53
• 2.2 方法53-59
• 2.3 結(jié)果59-65
• 2.4 討論65-66
• 2.5 小結(jié)66-67
• 第三章 狂犬疫苗糖蛋白時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑的研制67-83
• 3.1 材料67-69
• 3.2 方法69-74
• 3.3 結(jié)果74-81
• 3.4 討論81-82
• 3.5 結(jié)論82-83
• 第四章 乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標(biāo)記時(shí)間分辨免疫分析試劑的研制83-98
• 4.1 材料83-85
• 4.2 方法85-90
• 4.3 結(jié)果90-96
• 4.4 討論96-97
• 4.5 結(jié)論97-98
• 參考文獻(xiàn)98-108
• 中英文縮略詞108-110
• 博士期間論文發(fā)表情況110-112
• 致謝112-114
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明114

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本文編號(hào)：533108