本文關(guān)鍵詞：microRNA-34a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化在血管損傷修復(fù)及重塑中的作用及機(jī)制

  更多相關(guān)文章： microRNA-34a 血管平滑肌細(xì)胞 表型轉(zhuǎn)化 內(nèi)膜新生 血管疾病

【摘要】：研究背景及目標(biāo)：以動脈粥樣硬化為基本組織病理改變的血管病變發(fā)生發(fā)展導(dǎo)致血管重塑和管腔狹窄過程中,血管穩(wěn)態(tài)的破壞、損傷修復(fù)失衡是最基本的特征。血管平滑肌細(xì)胞通過干/祖細(xì)胞分化及本身表型轉(zhuǎn)化參與血管損傷修復(fù)及病理性重塑。我們課題組既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)microRNA-34a(miR-34a)可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化為血管平滑肌細(xì)胞,然而對miR-34a是否調(diào)控成熟血管平滑肌細(xì)胞功能和血管病理重塑仍然知之甚少。本研究希望闡述miR-34a對血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化后增殖遷移功能以及血管損傷后新生內(nèi)膜形成的作用,并鑒定miR-34a靶基因,闡明其作用機(jī)制。研究方法：本研究分離小鼠原代血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng),利用體外平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化模型,觀察miR-34a表達(dá)變化,并過表達(dá)或抑制miR-34a,研究miR-34a對血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。其次,利用生物信息學(xué)分析、分子克隆等方法鑒定miR-34a的功能性靶基因。最后,建立小鼠股動脈導(dǎo)絲損傷內(nèi)膜病理性增生模型,在損傷血管局部過表達(dá)miR-34a,研究miR-34a對血管損傷后內(nèi)膜新生的作用。結(jié)果：原代血管平滑肌細(xì)胞經(jīng)歷血清饑餓,FBS、PDGF-BB、ox-LDL刺激后表型由“收縮型”向“增殖遷移型”轉(zhuǎn)化,在此過程中miR-34a表達(dá)顯著下降。功能研究中,細(xì)胞計數(shù)和BrdU實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-34a抑制FBS、PDGF-BB誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖,劃痕實驗和Transwell實驗則表明過表達(dá)miR-34a減弱平滑肌細(xì)胞遷移能力,反之抑制miR-34a表達(dá)可增加平滑肌細(xì)胞增殖、遷移能力。多個miRNA的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫和RNA結(jié)構(gòu)分析軟件預(yù)測Notchl是miR-34a的靶基因。平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)miR-34a在mRNA和蛋白水平下調(diào)Notch1表達(dá),而抑制miR-34a則Notchl表達(dá)升高。分子克隆和熒光素酶報告實驗表明,miR-34a高表達(dá)能顯著降低Notchl 3'UTR調(diào)控的熒光素酶活性,而對Notchl 3'UTR中miR-34a結(jié)合位點進(jìn)行突變后,miR-34a對熒光素酶活性的抑制作用被消除。miR-34a和Notchl過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)miR-34a抑制平滑肌細(xì)胞增殖、遷移,而同時高表達(dá)Notch1可消除miR-34a的作用。成功建立小鼠股動脈導(dǎo)絲損傷內(nèi)膜增生模型,發(fā)現(xiàn)miR-34a在血管損傷后內(nèi)膜增生過程中顯著下降,損傷血管局部高表達(dá)miR-34a可明顯減輕血管損傷后內(nèi)膜新生。此外,miR-34a高表達(dá)減弱Notchl在血管中表達(dá),減少血管新生內(nèi)膜中PCNA陽性細(xì)胞比例,從體內(nèi)實驗層面驗證了miR-34a下調(diào)Notchl抑制平滑肌細(xì)胞增殖。結(jié)論：本研究成功揭示了miR-34a在血管平滑肌細(xì)胞中的新功能。miR-34a抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化后的增殖及遷移能力。Notch1是miR-34a的功能性靶基因,miR-34a直接結(jié)合Notch1 mRNA的3’UTR,下調(diào)Notch1表達(dá),并通過調(diào)控Notch1影響平滑肌細(xì)胞功能。在血管損傷內(nèi)膜病理性增生過程中,miR-34a過表達(dá)顯著減輕新生內(nèi)膜。miR-34a可能是防治平滑肌細(xì)胞相關(guān)血管疾病的新靶點。
【關(guān)鍵詞】：microRNA-34a 血管平滑肌細(xì)胞 表型轉(zhuǎn)化 內(nèi)膜新生 血管疾病
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 致謝5-7
• 前言7-9
• 中文摘要9-11
• 英文摘要11-14
• 縮略詞表14-22
• 引言22-24
• 第一部分 miR-34a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞功能24-53
• 1. 材料24-27
• 1.1 小鼠24
• 1.2 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑24
• 1.3 其他試劑及緩沖液24-25
• 1.4 常用儀器及耗材25-26
• 1.5 所用分析軟件26-27
• 2. 方法27-36
• 2.1 小鼠血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)27-28
• 2.2 血管平滑肌細(xì)胞傳代培養(yǎng)28
• 2.3 血管平滑肌細(xì)胞體外表型轉(zhuǎn)化研究模型28-29
• 2.4 平滑肌細(xì)胞miRNA模擬物(mimics)和抑制劑(inhibitors)轉(zhuǎn)染29-30
• 2.5 細(xì)胞中總RNA提取30
• 2.6 miRNA cDNA合成與實時定量PCR(RT-qPCR)30-32
• 2.7 平滑肌細(xì)胞增殖實驗32-33
• 2.8 平滑肌細(xì)胞遷移實驗33-34
• 2.9 平滑肌細(xì)胞凋亡實驗34-35
• 2.10 統(tǒng)計分析35-36
• 3. 結(jié)果36-51
• 3.1 成功分離血管平滑肌細(xì)胞并體外培養(yǎng)36-38
• 3.2 miR-34a在多種病理生理因素刺激下的血管平滑肌細(xì)胞中顯著下降38-39
• 3.3 血管平滑肌細(xì)胞中成功高表達(dá)和抑制miR-34a39-40
• 3.4 miR-34a抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖40-42
• 3.5 miR-34a抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移42-48
• 3.6 miR-34a不影響血管平滑肌細(xì)胞凋亡48-51
• 4. 討論51-53
• 第二部分 miR-34a調(diào)控Notch1表達(dá)影響平滑肌細(xì)胞功能53-80
• 1. 材料53-56
• 1.1 細(xì)胞培養(yǎng)試劑53
• 1.2 分子生物學(xué)常用試劑及緩沖液53-55
• 1.3 常用儀器及耗材55
• 1.4 統(tǒng)計及分析軟件55-56
• 2. 方法56-67
• 2.1 預(yù)測并篩選miR-34a靶基因56
• 2.2 靶基因Notchl 3'UTR熒光素酶報告基因構(gòu)建56-61
• 2.3 靶基因Notchl 3'UTR 上 miR-34a結(jié)合位點突變61-63
• 2.4 熒光素酶報告實驗和β-gal活性檢測63
• 2.5 Western Blot蛋白檢測63-65
• 2.6 平滑肌細(xì)胞miR-34a模擬物和Notch1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染65-66
• 2.7 平滑肌細(xì)胞功能實驗66
• 2.8 統(tǒng)計分析方法66-67
• 3. 結(jié)果67-78
• 3.1 生物信息學(xué)分析顯示Notch1是miR-34a的靶基因67-68
• 3.2 miR-34a在mRNA和蛋白水平調(diào)控Notch1表達(dá)68-69
• 3.3 miR-34a通過直接結(jié)合Notchl 3'UTR上的結(jié)合位點下調(diào)Notch1表達(dá)69-71
• 3.4 Notch1介導(dǎo)miR-34a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移功能71-78
• 4. 討論78-80
• 第三部分 miR-34a對小鼠股動脈損傷內(nèi)膜增生的影響80-96
• 1. 材料80-82
• 1.1 小鼠80
• 1.2 動物實驗手術(shù)器械80
• 1.3 常用試劑及緩沖液80-81
• 1.4 常用儀器及耗材81
• 1.5 統(tǒng)計分析軟件81-82
• 2. 方法82-86
• 2.1 小鼠股動脈導(dǎo)絲損傷內(nèi)膜增生模型82
• 2.2 小鼠在體miR-34a過表達(dá)干預(yù)導(dǎo)絲損傷血管82-83
• 2.3 小鼠血管組織RNA提取及檢測83
• 2.4 小鼠血管取材及石蠟包埋切片83-84
• 2.5 血管石蠟切片HE染色分析84
• 2.6 血管石蠟切片免疫染色84-85
• 2.7 統(tǒng)計分析85-86
• 3. 結(jié)果86-94
• 3.1 成功建立小鼠股動脈導(dǎo)絲損傷內(nèi)膜病理性增生模型86-87
• 3.2 血管損傷后miR-34a表達(dá)顯著降低87-89
• 3.3 在體miR-34a高表達(dá)減輕血管損傷后內(nèi)膜病理性增生89-91
• 3.4 miR-34a通過下調(diào)Notch1表達(dá)減輕血管損傷后內(nèi)膜病理性增生91-94
• 4. 討論94-96
• 總結(jié)與展望96-98
• 結(jié)論98-99
• 參考文獻(xiàn)99-110
• 綜述110-160
• 參考文獻(xiàn)132-160
• 作者簡歷及在學(xué)期間所取得的科研成果160-162

，

本文編號：519224