本文關(guān)鍵詞：FTY-720調(diào)節(jié)去勢大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化Smad信號通路的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者因為本身雌激素水平的下降,導(dǎo)致全身骨骼系統(tǒng)代謝平衡紊亂,直至骨質(zhì)疏松,因此絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥實質(zhì)上是一種骨代謝異常引起的代謝類疾病。我國中老年婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率據(jù)不完全統(tǒng)計已達(dá)到50%,其根本原因是破骨細(xì)胞的骨吸收作用和成骨細(xì)胞的骨形成作用嚴(yán)重失衡,導(dǎo)致骨量減少和骨顯微結(jié)構(gòu)退化變性,使得骨質(zhì)脆弱,骨折發(fā)生率高。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥也是造成頜面部骨質(zhì)損失的主要危險因素,此種情況一旦發(fā)生,不僅可導(dǎo)致牙槽骨的吸收,還可發(fā)生更為嚴(yán)重的牙齦萎縮、牙根暴露、基牙附著喪失、基牙脫落甚至頜骨萎縮等一系列不利于臨床正畸治療的棘手問題,給患者帶來了痛苦和生活質(zhì)量的下降,同時也給正畸科臨床醫(yī)生的治療帶來巨大的障礙。當(dāng)前臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要采取激素替代療法,或用鈣和其他藥物制劑來抑制骨吸收。由于藥物制劑本身有副作用,再加上吸收不良,療效不穩(wěn)定,患者依從性差等一系列不可控因素,這些方法不能取得令人滿意的治療效果。來源于動物骨髓中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMMSCs),具有成體干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能,能分化為成骨細(xì)胞,促進(jìn)骨的生長、形成以及骨的修復(fù)過程。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的同時,來源于患者體內(nèi)的BMMSCs其成骨分化能力在基因水平衍生出了明顯的缺陷,有研究表明引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨質(zhì)流失的一個重要因素就是其體內(nèi)BMMSCs的成骨分化減弱,而成脂分化增強。目前還沒有找到確鑿可靠的方法從基因水平改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者BMMSCs成骨分化能力減弱的狀況。FTY-720 (fingolimod,芬戈莫德)是1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, SIP)的化學(xué)類似物。最初由日本學(xué)者從中草藥冬蟲夏草的有效成分多球殼菌素ISP-1改造而成,作為一種新型的免疫制劑廣泛應(yīng)用于臨床。近來研究發(fā)現(xiàn),FTY-720有促進(jìn)成骨樣細(xì)胞系向成骨分化的能力。然而,FTY-720能否改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者BMMSCs受損的成骨能力至今未見報道,且FTY-720促進(jìn)成骨的相關(guān)機制也未見有相關(guān)研究。Smad信號通路是成骨分化過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用的信號通路之一。Smads蛋白家族充斥在這個通路各個環(huán)節(jié)中,而其中的Smad4蛋白處于Smad信號通路中游水平,它在分類上屬于通用型轉(zhuǎn)運蛋白,可以與Smads蛋白家族中的受體型Smad1、2、3、5、8耦合輔助其轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi),調(diào)控下游基因的表達(dá),可見其作用之重要。因此,本課題的目的旨在首先驗證FTY-720能否從基因水平改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型的BMMSCs的成骨分化缺陷,然后通過針對Smad4基因設(shè)計siRNA序列構(gòu)建慢病毒載體,感染骨質(zhì)疏松動物模型的BMMSCs形成shRNA (Short hairpin RNA,短發(fā)夾樣RNA)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,抑制細(xì)胞內(nèi)Smad信號通路中Smad4蛋白的表達(dá)從而阻斷Smad信號通路,再次驗證FTY-720能否在基因水平改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型的BMMSCs的成骨分化能力。初步探尋FTY-720促成骨作用的相關(guān)機制。為達(dá)此目的,本課題設(shè)計了以下研究內(nèi)容。研究內(nèi)容：1)建立去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型SD大鼠首先分為兩組：去勢組(OVX)和假手術(shù)組(SHAM)-OVX組直接用外科手術(shù)方法將雌性SD大鼠雙側(cè)卵巢行卵巢切除術(shù)(ovariectomy, OVX),此組即是用來建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的動物模型組；另一SHAM組則在相同條件下只切除卵巢周圍等量的脂肪組織。大約90天過后,分別對兩組大鼠進(jìn)行稱重,并用Micro-CT掃描儀對骨密度(BMD)、骨小梁厚度指數(shù)(trabecular thickness, Tb.Th)和骨小梁體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction, BVF)進(jìn)行測量,以鑒定大鼠骨質(zhì)疏松動物模型是否建立成功。2)不同濃度梯度FTY-720對OVX大鼠BMMSCs成骨分化的影響動物模型一旦確認(rèn)構(gòu)建成功,則利用全骨髓貼壁法結(jié)合酶消化時間控制的方法來分離純化rBMMSCs (rat BMMSCs,大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)。用倒置顯微鏡來觀察細(xì)胞形態(tài),應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)來檢測細(xì)胞表面標(biāo)記分子的表達(dá),使用MTT法對細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測,利用成骨、成脂誘導(dǎo)實驗檢測細(xì)胞的多向分化能力。配制1nM、10nM、100 nM三個濃度梯度的FTY-720成骨誘導(dǎo)液,對分別來自O(shè)VX組與SHAM組的rBMMSCs連續(xù)誘導(dǎo)21天,在7、14、21天時檢測細(xì)胞成骨相關(guān)基因(Runx2、Sp7、OCN、ALP) mRNA的表達(dá)水平,在21天時檢測這些基因的蛋白表達(dá)水平,從而判斷細(xì)胞的成骨分化狀況。3)慢病毒介導(dǎo)的Smad4基因沉默對FTY-720增強rBMMSCs成骨能力的影響根據(jù)在基因庫里查詢到的大鼠Smad4的基因信息,使用Invitrogen在線siRNA序列設(shè)計軟件,設(shè)計合成3條針對目的基因CDS區(qū)的siRNA序列以及一條無意義的亂序排列的siRNA-Negative序列作為對照組應(yīng)用于實驗中。然后依照第條siRNA序列的堿基編碼,設(shè)計出互補的兩條DNA模板單鏈,再按照反應(yīng)體系合成出相應(yīng)的DNANA單鏈。DNA單鏈退火完成后,與shRNA質(zhì)粒的表達(dá)載體(GV112 Vector)進(jìn)行連接反應(yīng)后送至基因公司進(jìn)行基因測序。將測序結(jié)果與設(shè)計相一致的shRNA1、shRNA2、shRNA3制備已經(jīng)編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒載體pGV-LV,重組病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功后,即對質(zhì)粒的DNA進(jìn)行去內(nèi)毒素抽提；使用HEK-293T細(xì)胞接受shRNA病毒表達(dá)載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染,而后對病毒轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行觀察。采用qRT-PCR和Western blot的方法檢測293T細(xì)胞的Smad4基因被干擾后,其內(nèi)源性Smad4基因的mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平以驗證干擾是否成功。再根據(jù)結(jié)果用干擾效率最高的shRNA2病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株繼續(xù)下一步研究。在293T細(xì)胞內(nèi)包裝和生產(chǎn)慢病毒顆粒的步驟完成后,測定病毒滴度。按照梯度稀釋法以重組慢病毒顆粒過夜感染去勢組大鼠BMMSCs,篩選能夠達(dá)到有效感染效率(80%以上)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。qRT-PCR(?)Vestern Blot分別檢測去勢大鼠BMMSCs穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株內(nèi)Smad4基因干擾和蛋白抑制的效率。然后繼續(xù)用qRT-PCR和Western blot的方法檢測10 nM FTY-720誘導(dǎo)下去勢大鼠BMMSCs穩(wěn)轉(zhuǎn)株成骨相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)情況,以評價Smad4基因靶向抑制對FTY-720促rBMMSCs-OVX成骨作用的影響。4)慢病毒介導(dǎo)的Smad4基因沉默對去勢大鼠顱骨缺損模型在FTY-720促成骨作用下愈合質(zhì)量的影響首先用手術(shù)方法構(gòu)建去勢大鼠顱骨直徑為7mm圓形缺損模型,用明膠海綿分別復(fù)合穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(shRNA2慢病毒表達(dá)載體感染去勢大鼠BMMSCs穩(wěn)定沉默Smad4的轉(zhuǎn)染細(xì)胞)和正常的去勢大鼠BMMSCs(對照)充填于骨缺損處,5周后行Micro-CT掃描檢測顱骨缺損處骨形成情況,以評價FTY-720對去勢大鼠的骨修復(fù)作用,以及靶向抑制了Smad4基因后此作用的消失。研究結(jié)果①術(shù)后3個月,兩組間大鼠體重、骨密度、骨小梁厚度指數(shù)及骨小梁體積分?jǐn)?shù)均具有統(tǒng)計學(xué)差異。去勢組大鼠體重增加,股骨、脛骨骨密度、骨小梁厚度指數(shù)及骨小梁體積分?jǐn)?shù)都降低。②體外采用全骨髓自然貼壁篩選法結(jié)合酶消化時間控制方法分離培養(yǎng)的rBMMSCs其形態(tài)大部分為長梭形或者多角形,可以長滿整個培養(yǎng)皿底,MTT曲線是典型的“S”形,且從第4天開始OVX組BMMSCs的OD值高于SHAM組。細(xì)胞表面標(biāo)志物為間充質(zhì)標(biāo)記物CD29,CD44, CD90和血管細(xì)胞黏附分子CD106呈現(xiàn)強陽性；造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34和CD45呈陰性。并具有向成骨、成脂方向分化的能力,證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是rBMMSCs。③構(gòu)建了1 nM,10 nM,100 nM三個濃度的FTY-720成骨誘導(dǎo)液分別對rBMMSCs-OVX(云勢組大鼠的BMMSCs)和rBMMSCs-SHAM(假手術(shù)組大鼠的BMMSCs)進(jìn)行了成骨誘導(dǎo),這三組培養(yǎng)液均能使細(xì)胞的成骨相關(guān)基因(Runx2、Sp7、OCN、ALP) mRNA的表達(dá)和蛋白表達(dá)增高,其中以10nM組的最高,促進(jìn)成骨能力最強。④對作為表達(dá)載體的質(zhì)粒GV112進(jìn)行酶切線性化處理后與設(shè)計的3條siRNA成功進(jìn)行了連接及轉(zhuǎn)化,制備出用于感染的4種shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體(包括用于對照的Negative組)。⑤對基因重組后的4種慢病毒質(zhì)粒載體成功進(jìn)行了慢病毒的包裝、感染和純化,qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示shRNA2的慢病毒表達(dá)載體干擾效率最高,所以選用以shRNA2序列為基礎(chǔ)的慢病毒顆粒構(gòu)建rBMMSCs-OVX的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。⑥成功構(gòu)建了rBMMSCs-OVX+Lenti-shRNA2 (LV-S2-OVX)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示LV-S2-OVX急轉(zhuǎn)細(xì)胞株的Smad4基因mRNA水平與蛋白水平均被明顯抑制。⑦與對照組無意義序列shRNA病毒感染細(xì)胞株相比(rBMMSCs-OVX+shRNA-Negative),10nM的FTY-720誘導(dǎo)液條件下LV-S2-OVX穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的成骨相關(guān)基因(Runx2、Sp7、OCN、 ALP) mRNA和蛋白的表達(dá)水平被明顯抑制。⑧Mcro-CT掃描結(jié)果顯示無意義鏈病毒感染細(xì)胞株LV-Neg-OVX復(fù)合明膠海綿修復(fù)骨缺損,術(shù)區(qū)有較明顯新骨形成。而穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(LV-S2-OVX)組的術(shù)區(qū)無新骨形成,骨缺損清晰可見。研究結(jié)論1)采用以全骨髓貼壁篩選法為基礎(chǔ),結(jié)合酶消化時間的控制來分離培養(yǎng)rBMMSCs-OVX與rBMMSCs-SHAM這兩組細(xì)胞,其純化和擴(kuò)增效果良好；再根據(jù)其生物學(xué)特性,以流式細(xì)胞術(shù)檢測的表型特征為參考,便能對rBMMSCs進(jìn)行鑒定。而OVX手術(shù)本身不會改變rBMMSCs的表型特征。2) 1 nM,10 nM,100 nM 三個濃度的FTY-720都可以促進(jìn)rBMMSCs-OVX的體外成骨分化能力,其中以10nM的FTY-720促成骨分化能力最強。3)構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株CrBMMSCs-OVX+Lenti-shRNA2, LV-S2-OVX)對大鼠BMMSCs的Smad4基因的干擾效率高,穩(wěn)定性好。4)抑制了Smad信號通路核心因子Smad4基因后,FTY-720的促成骨分化作用明顯降低,說明FTY-720的促成骨分化作用是通過Smad信號通路實現(xiàn)的。5)體內(nèi)實驗證實,抑制了Smad4基因,FTY-720不能促進(jìn)骨形成。
【關(guān)鍵詞】：1-磷酸鞘氨醇 芬戈莫德 骨質(zhì)疏松癥 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨分化 Smad信號通路 RNA干擾 短發(fā)夾RNA
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R580
【目錄】：

• 縮略語表9-13
• 中文摘要13-18
• Abstract18-23
• 前言23-26
• 文獻(xiàn)回顧26-53
• 一、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展26-30
• 1. 骨質(zhì)疏松癥的基本概念26
• 2. 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的現(xiàn)狀26-27
• 3. 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥與牙槽骨吸收27-28
• 4. 治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者牙槽骨吸收目前存在的難題28-30
• 二、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞30-39
• 1. BMMSCs的多向分化潛能31-33
• 1.1 成骨分化31-32
• 1.2 成脂分化32
• 1.3 向神經(jīng)組織分化32-33
• 1.4 成軟骨分化33
• 1.5 向肌組織分化33
• 2. BMMSCs的分離方法與表型鑒定33-35
• 3. BMMSCs與骨質(zhì)疏松癥35-36
• 4. BMMSCs在骨組織修復(fù)和改建中的應(yīng)用36-39
• 三、1-磷酸鞘氨醇和FTY-72039-46
• 1. S1P的代謝過程39-42
• 2. S1P的生物學(xué)功能42-43
• 3. S1P在維持骨代謝動態(tài)平衡中的作用43-44
• 4. S1P可促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化44-45
• 5. FTY-720是S1P的化學(xué)類似物45-46
• 四、Smad信號通路與成骨分化46-48
• 1. Smads蛋白家族成員46-47
• 2. Smad信號通路的活化過程47
• 3. Smad信號通路在成骨分化過程中的作用47-48
• 五、以慢病毒為載體的RNA干擾技術(shù)48-51
• 1. RNAi的發(fā)現(xiàn)48
• 2. RNAi的作用機制48-50
• 3. RNAi技術(shù)載體的選擇50-51
• 六、本課題的意義51-53
• 第一部分 去勢大鼠骨質(zhì)疏松動物模型的建立53-60
• 1 材料53-54
• 1.1 實驗動物53
• 1.2 實驗主要試劑53-54
• 1.3 實驗主要儀器54
• 2 方法54-56
• 2.1 建模方法54-55
• 2.2 動物模型鑒定55-56
• 3 結(jié)果56-58
• 3.1 一般情況56
• 3.2 建模后OVX組與SHAM組大鼠間體重的比較56-57
• 3.3 建模后OVX組與SHAM組大鼠Micro-CT三維重建后形態(tài)學(xué)分析57-58
• 3.4 建模后OVX組與SHAM組大鼠BMD、Tb.Th、BVF的測定結(jié)果58
• 4 討論58-60
• 第二部分 不同濃度梯度FTY-720對rBMMSCs成骨分化的影響60-82
• 1 材料60-62
• 1.1 實驗動物60-61
• 1.2 實驗主要試劑61-62
• 1.3 實驗主要儀器62
• 2 方法62-72
• 2.1 rBMMSCs的分離和培養(yǎng)62-64
• 2.1.1 原代培養(yǎng)62-63
• 2.1.2 傳代培養(yǎng)63
• 2.1.3 多向分化培養(yǎng)63-64
• 2.2 rBMMSCs的表型鑒定64
• 2.3 MTT法檢測rBMMSCs增殖能力64-65
• 2.4 不同濃度梯度FTY-720誘導(dǎo)rBMMSCs分組情況65
• 2.5 不同濃度梯度FTY-720對rBMMSCs的成骨誘導(dǎo)65
• 2.6 qRT-PCR檢測rBMMSCs成骨相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)65-69
• 2.6.1 細(xì)胞總RNA的提取66-67
• 2.6.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA67
• 2.6.3 Real-time PCR檢測67-69
• 2.7 Western blot檢測成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)69-72
• 2.7.1 細(xì)胞總蛋白樣本制備69
• 2.7.2 全蛋白樣本濃度測定69-70
• 2.7.3 蛋白樣本的處理70
• 2.7.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)70-71
• 2.7.5 轉(zhuǎn)膜(PVDF膜濕轉(zhuǎn))71
• 2.7.6 封閉71
• 2.7.7 一抗的孵育71-72
• 2.7.8 抗的孵育72
• 2.7.9 顯影72
• 2.8 統(tǒng)計學(xué)分析72
• 3 結(jié)果72-79
• 3.1 rBMMSCs形態(tài)學(xué)觀察72-73
• 3.2 茜素紅S染色73-74
• 3.3 油紅O染色74
• 3.4 rBMMSCs表面標(biāo)記物鑒定74-76
• 3.5 細(xì)胞生長曲線測定76
• 3.6 FTY-720成骨誘導(dǎo)rBMMSCs后的形態(tài)學(xué)觀察76-77
• 3.7 qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因表達(dá)77-78
• 3.8 Western blot檢測成骨相關(guān)蛋白表達(dá)含量78-79
• 4 討論79-82
• 第三部分 慢病毒介導(dǎo)的Smad4基因沉默對FTY-720增強BMMSCs成骨能力的影響82-108
• 1 材料83-85
• 1.1 實驗對象83
• 1.2 實驗主要試劑83-84
• 1.3 實驗主要儀器84-85
• 1.4 主要試劑的配制85
• 2 方法85-98
• 2.1 針對Smad4基因的shRNA表達(dá)載體構(gòu)建85-93
• 2.1.1 感受態(tài)大腸桿菌的制備85-86
• 2.1.2 siRNA序列的設(shè)計86-88
• 2.1.3 雙鏈DNA模板設(shè)計與單鏈DNA合成88
• 2.1.4 單鏈DNA退火形成雙鏈DNA88-89
• 2.1.5 對質(zhì)粒表達(dá)載體(GV112)進(jìn)行酶切線性化處理89-90
• 2.1.6 shRNA與載體的連接90-91
• 2.1.7 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化91
• 2.1.8 陽性克隆的PCR鑒定91-92
• 2.1.9 質(zhì)粒提取92-93
• 2.1.10 質(zhì)粒酶切和測序鑒定93
• 2.2 慢病毒干擾載體的包裝和感染93-95
• 2.2.1 HEK-293T細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代93
• 2.2.2 HEK-293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染93-94
• 2.2.3 干擾效率評價94-95
• 2.3 rBMMSCs-OVX穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建95-97
• 2.3.1 病毒純化95
• 2.3.2 病毒滴度的測定95-96
• 2.3.3 病毒滴度的計算96
• 2.3.4 慢病毒感染rBMMSCs-OVX96-97
• 2.3.5 qRT-PCR檢測rBMMSCs-OVX細(xì)胞中Smad4基因的表達(dá)變化97
• 2.3.6 Western blot檢測rBMMSCs-OVX細(xì)胞中Smad4蛋白表達(dá)情況97
• 2.4 Smad4基因靶向抑制對FTY-720促rBMMSCs-OVX成骨分化的影響97
• 2.4.1 qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)97
• 2.4.2 Western blot檢測成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)97
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析97-98
• 3 結(jié)果98-106
• 3.1 測序鑒定結(jié)果98-100
• 3.2 HEK-293T細(xì)胞中Smad4基因干擾效率評價100-102
• 3.2.1 qRT-PCR檢測HEK-293T細(xì)胞中Smad4基因mRNA的表達(dá)100
• 3.2.2 Western blot檢測HEK-293T細(xì)胞內(nèi)Smad4蛋白水平100-102
• 3.3 rBMMSCs-OVX的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Smad4基因干擾效果102-103
• 3.3.1 rBMMSCs-OVX的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Smad4的mRNA表達(dá)102
• 3.3.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株LV-S2-OVX的Smad4蛋白水平的表達(dá)102-103
• 3.4 慢病毒介導(dǎo)的Smad4基因干擾對10 nM FTY-720促成骨作用的影響103-106
• 3.4.1 Smad4基因干擾對10 nM FTY-720誘導(dǎo)rBMMSCs成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響103-104
• 3.4.2 Smad4基因干擾對10 nM FTY-720誘導(dǎo)rBMMSCs成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的影響104-106
• 4 討論106-108
• 第四部分 慢病毒介導(dǎo)的Smad4基因沉默對OVX大鼠顱骨缺損模型在FTY-720促成骨作用下愈合質(zhì)量的影響108-113
• 1 材料109-110
• 1.1 實驗動物與細(xì)胞109
• 1.2 實驗主要試劑109
• 1.3 實驗的主要儀器109-110
• 2 方法110-111
• 2.1 大鼠顱骨骨缺損模型建模方法110
• 2.2 復(fù)合支架材料的植入及實驗分組110
• 2.3 Micro-CT掃描觀察顱骨缺損修復(fù)情況110
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)分析110-111
• 3 結(jié)果111
• 3.1 Micro-CT掃描結(jié)果111
• 4 討論111-113
• 全文總結(jié)113-115
• 參考文獻(xiàn)115-129
• 個人簡歷和研究成果129-130
• 致謝130

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉敬,許增祿,王計奎,徐園園,錢曉菁;絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥Ⅰ型膠原代謝的變化[J];解剖學(xué)報;2002年02期

2 盧守蓮,程云英;正常及去勢大鼠骨組織形態(tài)的比較研究[J];南京鐵道醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2001年02期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 劉敬;絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥細(xì)胞外基質(zhì)病因機理的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

2 賀軼宇;溫度敏感性水凝膠攜帶HMGB1治療大鼠心肌梗死的實驗研究[D];武漢大學(xué);2013年

3 邢穎;FTY720誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、增強化療藥物敏感性的作用及其機制研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2013年

4 李銳冬;BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨與促進(jìn)骨肉瘤生長的調(diào)控機制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

5 范春玲;BMP信號對大鼠脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育及功能的影響[D];中南大學(xué);2013年

6 張永強;CKIP-1在小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合中的作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 張劍鋒;骨質(zhì)疏松癥Ⅰ型膠原的變化及其與骨密度、骨生物力學(xué)的相關(guān)性研究[D];山東大學(xué);2006年

2 劉吉英;miR-26b靶向Smad4調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的分子機制[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 陳冰;芬戈莫德的合成及質(zhì)量研究[D];吉林大學(xué);2014年

4 姚泉;TGF-β/Smad相關(guān)蛋白在增生性瘢痕中心區(qū)和邊緣區(qū)的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2014年

5 郭艷霞;HCMV經(jīng)TGFβ/Smad信號通路對絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞Smad4表達(dá)影響的體外研究[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2014年

6 安外爾·熱合曼;MSTN/Smad信號通路與吐魯番黑羊肌肉生長發(fā)育、產(chǎn)肉性能關(guān)聯(lián)性的研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：FTY-720調(diào)節(jié)去勢大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化Smad信號通路的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：509455