本文關(guān)鍵詞：尼古丁通過激活大麻素受體減輕Aβ1-42所致神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能減退。研究表明,AD發(fā)生認(rèn)知功能減退的重要原因之一是腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用,過量的Aβ可損傷神經(jīng)元和激活小膠質(zhì)細(xì)胞。因此,降低Aβ的神經(jīng)毒性是防治AD的主要方法之一。一些流行病學(xué)研究顯示,吸煙人群AD發(fā)病率明顯低于非吸煙人群,提示煙草中的主要成分尼古丁可能具有抗Aβ所致的神經(jīng)損傷作用,但其作用機(jī)制尚未完全闡明。大量文獻(xiàn)證明,激活腦內(nèi)大麻素(cannabinoid,CB)系統(tǒng)具有神經(jīng)保護(hù)作用。大麻素CB1受體激活后可保護(hù)神經(jīng)元,大麻素CB2受體激活可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化。此外,饒有興味的是,大麻素受體拮抗劑可用于治療尼古丁成癮,天然大麻素四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol,THC)也可減輕尼古丁戒斷癥狀。上述證據(jù)提示,尼古丁的部分生物學(xué)效應(yīng)可能通過大麻素受體介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)我們將神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞暴露于Aβ1-42,建立Aβ神經(jīng)元損傷模型,觀察尼古丁對HT22細(xì)胞的保護(hù)作用;采用Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞系N9細(xì)胞,建立Aβ小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型,觀察尼古丁抑制N9細(xì)胞過度活化的作用;并對大麻素受體和PKC(protein kinase C,PKC)在其中的作用進(jìn)行探索。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),CB1受體介導(dǎo)了尼古丁保護(hù)HT22細(xì)胞抗Aβ1-42損傷;CB2受體介導(dǎo)了尼古丁抑制Aβ1-42引起的N9細(xì)胞激活;尼古丁通過大麻素受體產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用需要PKC的參與。由于煙草戒斷研究中發(fā)現(xiàn)小劑量尼古丁制劑(如電子香煙、尼古丁貼片)具有低毒性、低成癮性等優(yōu)點(diǎn),本研究的結(jié)果將為探明尼古丁的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制和拓寬尼古丁的可能臨床適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)證據(jù),也為AD的治療方法提供了新思路。第一部分大麻素CB1受體介導(dǎo)尼古丁保護(hù)神經(jīng)元的研究實(shí)驗(yàn)一尼古丁對神經(jīng)元的保護(hù)作用觀察目的:Aβ神經(jīng)元損傷模型的建立和尼古丁(nicotine,Nico)最佳保護(hù)濃度的確定。方法:將HT22細(xì)胞分為對照組和1、5、10μM的Aβ1-42損傷組,孵育24 h后,用噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)方法以檢測細(xì)胞活力。隨后,將HT22細(xì)胞分為6組,分別為對照組、5μM的Aβ1-42損傷組和不同濃度(1、10、100和500μM)的尼古丁保護(hù)組,孵育24 h后,MTT法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果:5μM的Aβ1-42損傷24 h,可降低HT22細(xì)胞活力至對照組的60%左右,選擇5μM作為Aβ1-42的損傷濃度進(jìn)行隨后實(shí)驗(yàn)。100μM的尼古丁,可顯著恢復(fù)細(xì)胞活力,選擇100μM的尼古丁進(jìn)行隨后機(jī)制研究。結(jié)論:我們選擇5μM Aβ1-42建立神經(jīng)元損傷模型,使用100μM尼古丁研究其保護(hù)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)二CB1受體介導(dǎo)尼古丁對神經(jīng)元的保護(hù)作用目的:觀察大麻素CB1受體在尼古丁保護(hù)HT22細(xì)胞中的作用。方法:將HT22細(xì)胞分為5組,分別為空白對照組(Control)、Aβ?lián)p傷組、Nico保護(hù)組、CB1拮抗劑AM251干預(yù)組和AM251對照組。孵育24 h,MTT法檢測細(xì)胞活力、比色法檢測培養(yǎng)基內(nèi)乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)含量、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率、Western blot觀測CB1蛋白和凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、Bax表達(dá)。結(jié)果:與Aβ?lián)p傷組比較,Nico保護(hù)組細(xì)胞活力增加(P0.05),LDH釋放減少(P0.05),細(xì)胞凋亡率降低(P0.05),CB1和Bcl2表達(dá)上調(diào)(P0.05),Bax表達(dá)下調(diào)(P0.05)。CB1拮抗劑AM251顯著逆轉(zhuǎn)了尼古丁的上述作用(P0.05)。結(jié)論:CB1受體介導(dǎo)了尼古丁對HT22細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)三PKC在尼古丁保護(hù)神經(jīng)元中的作用目的:觀察PKC在尼古丁保護(hù)HT22細(xì)胞中的作用。方法:將HT22細(xì)胞分為5組,分別為空白對照組(Control)、Aβ?lián)p傷組、Nico保護(hù)組、CB1拮抗劑AM251干預(yù)組和AM251對照組。采用Western blot測定細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PKC蛋白表達(dá),計(jì)算二者比值,檢測PKC激活程度。隨后,將HT22細(xì)胞分為5組,分別為空白對照組、Aβ?lián)p傷組、Nico保護(hù)組、PKC抑制劑白屈菜紅堿(chelerythrine,Che)干預(yù)組和Che對照組。處理24 h,采用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),MTT法測定細(xì)胞活力,并檢測LDH釋放量。結(jié)果:與Aβ?lián)p傷組相比,Nico保護(hù)組PKC激活水平顯著升高(P0.05);CB1拮抗劑AM251逆轉(zhuǎn)了尼古丁的上述作用(P0.05)。與Aβ?lián)p傷組相比,Nico保護(hù)組細(xì)胞形態(tài)改善,細(xì)胞活力增加,LDH釋放減少(P0.05);PKC抑制劑Che逆轉(zhuǎn)了尼古丁的上述作用(P0.05)。結(jié)論:PKC作為CB1受體信號下游介導(dǎo)了尼古丁對HT22細(xì)胞的保護(hù)作用。第二部分大麻素CB2受體介導(dǎo)尼古丁抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的研究實(shí)驗(yàn)一尼古丁抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用觀察目的:建立Aβ小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型和確定尼古丁最佳作用濃度。方法:將N9小膠質(zhì)細(xì)胞分為對照組(Control)和1、2.5、5、10μM的Aβ1-42刺激組。處理24 h,采用Western blot檢測細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)蛋白表達(dá)水平。隨后,將N9小膠質(zhì)細(xì)胞分為6組,分別為對照組、5μM的Aβ1-42刺激組和不同濃度(1、10、100、500μM)的尼古丁處理組,24 h后,ELISA法檢測培養(yǎng)基內(nèi)TNF-α和IL-6含量。結(jié)果:5μM的Aβ1-42顯著上調(diào)N9細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)(P0.05)。100μM的Nico顯著降低N9細(xì)胞TNF-α和IL-6釋放量(P0.05)。結(jié)論:我們選擇5μM Aβ1-42建立小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型,使用100μM尼古丁研究其抑制N9細(xì)胞活化的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)二尼古丁減輕小膠質(zhì)細(xì)胞激活的機(jī)制研究目的:探討尼古丁減輕N9小膠質(zhì)細(xì)胞活化的機(jī)制。方法:將N9細(xì)胞分為5組,分別為空白對照組(Control)、Aβ?lián)p傷組、Nico處理組、CB2拮抗劑AM630干預(yù)組和AM630對照組,孵育24 h,采用Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測CB2、i NOS、精氨酸酶-1(arginase 1,Arg-1)蛋白表達(dá);采用ELISA法測量培養(yǎng)基內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-10和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的濃度。隨后,將N9小膠質(zhì)細(xì)胞分為Control組、Aβ?lián)p傷組、Nico處理組、PKC抑制劑Che干預(yù)組和Che對照組,孵育24 h,檢測培養(yǎng)基內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-10和BDNF濃度。結(jié)果:與Aβ?lián)p傷組比較,Nico處理組細(xì)胞i NOS表達(dá)下調(diào)(P0.05),Arg-1表達(dá)上調(diào)(P0.05),其作用被CB2拮抗劑AM630逆轉(zhuǎn)(P0.05);Nico組培養(yǎng)基內(nèi)TNF-α和IL-6含量降低(P0.05),BDNF含量升高(P0.05),其作用被CB2拮抗劑或PKC抑制劑逆轉(zhuǎn)(P0.05)。結(jié)論:尼古丁通過CB2受體和PKC介導(dǎo)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化。
【關(guān)鍵詞】：尼古丁 大麻素受體 神經(jīng)保護(hù) HT22細(xì)胞 N9細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-35
• 第一部分 大麻素CB1受體介導(dǎo)尼古丁保護(hù)神經(jīng)元的研究35-60
• 實(shí)驗(yàn)一 尼古丁對神經(jīng)元的保護(hù)作用觀察35-41
• 1 材料35-36
• 2 方法36-37
• 3 結(jié)果37-38
• 4 討論38-41
• 實(shí)驗(yàn)二CB1受體介導(dǎo)尼古丁對神經(jīng)元的保護(hù)作用41-53
• 1 材料41-43
• 2 方法43-45
• 3 結(jié)果45-51
• 4 討論51-53
• 實(shí)驗(yàn)三 PKC在尼古丁保護(hù)神經(jīng)元中的作用53-60
• 1. 材料53-55
• 2 方法55-56
• 3 結(jié)果56-58
• 4 討論58-60
• 第二部分 大麻素CB2受體介導(dǎo)尼古丁抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的研究60-81
• 實(shí)驗(yàn)一 尼古丁抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用觀察60-68
• 1 材料60-62
• 2 方法62-63
• 3 結(jié)果63-66
• 4 討論66-68
• 實(shí)驗(yàn)二 尼古丁減輕小膠質(zhì)細(xì)胞激活的機(jī)制研究68-81
• 1 材料68-70
• 2 方法70-71
• 3 結(jié)果71-79
• 4 討論79-81
• 小結(jié)81-82
• 參考文獻(xiàn)82-100
• 個人簡歷和研究成果100-101
• 致謝101

  本文關(guān)鍵詞：尼古丁通過激活大麻素受體減輕Aβ1-42所致神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：494741