本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌感染對胃癌預(yù)后的影響及其機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,盡管當(dāng)前在胃癌的診斷和治療技術(shù)方面已經(jīng)取得了很大進(jìn)步,但腫瘤的高侵襲性和轉(zhuǎn)移率使胃癌的預(yù)后仍較差。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種微需氧革蘭氏陰性桿菌,流行病學(xué)、病理學(xué)以及體外試驗均表明,H.pylori感染是胃癌發(fā)生的重要危險因素之一。近年來不斷有研究探討H.pylori感染與胃癌預(yù)后的關(guān)聯(lián),但仍缺乏一致結(jié)論。微小RNA(microRNAs,mi RNAs)是一類長約18~22nt的單鏈非編碼RNA,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、代謝、增殖、凋亡、分化等生命活動,越來越多的證據(jù)表明miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本課題擬探討H.pylori感染對胃癌患者預(yù)后的影響及其可能的分子機(jī)制。目的(1)采用前瞻性隊列研究方法探討H.pylori感染與胃癌預(yù)后之間的關(guān)聯(lián);(2)闡明H.pylori陽性和H.pylori陰性胃癌組織的差異miRNA;(3)闡明差異表達(dá)的miR-143-3p對胃癌生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制,為臨床胃癌患者的個體化治療提供理論依據(jù),也為新藥的研發(fā)提供新的分子靶點。方法(1)課題組前期已建立了胃癌前瞻性研究隊列,納入自2007年至2009年在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受根治性手術(shù)的原發(fā)性胃癌患者261例,本研究采用免疫組化方法檢測H.pylori在胃癌組織和癌旁組織的表達(dá),用卡方檢驗分析H.pylori感染與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系,用kaplan-meier方法繪制生存曲線,并比較h.pylori陽性和h.pylori陰性胃癌患者的生存情況,通過cox單因素和多因素方法探討h.pylori感染對胃癌患者總生存(overallsurvival,os)和無病生存(disease-freesurvival,dfs)的影響;(2)從胃癌隊列中選取42對胃癌組織及其配對癌旁組織標(biāo)本,其中胃癌組織和癌旁組織h.pylori均陽性的21例,與其性別、年齡匹配的胃癌和癌旁組織h.pylori均陰性的21例。采用試劑盒提取石蠟組織樣品中的總rna,采用μparaflo@微流體芯片分別檢測h.pylori陽性的胃癌組織、h.pylori陰性的胃癌組織、h.pylori陽性的癌旁組織和h.pylori陰性的癌旁組織mirna表達(dá)譜,通過t檢驗比較兩組間mirna的表達(dá),從而篩選出h.pylori陽性和陰性的胃癌組織差異表達(dá)的mirna,以及h.pylori陽性和陰性的癌旁組織差異表達(dá)的mirna。選取差異顯著的mirna進(jìn)一步采用qrt-pcr進(jìn)行驗證,以明確h.pylori陽性和h.pylori陰性胃癌的差異mirna。(3)進(jìn)一步選取h.pylori陽性和陰性胃癌組織表達(dá)顯著差異的mir-143-3p深入研究,采用qrt-pcr檢測42例胃癌組織和癌旁組織mir-143-3p的表達(dá),采用qrt-pcr檢測mir-143-3p在正常胃上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中的表達(dá),選取合適的細(xì)胞進(jìn)行功能研究。轉(zhuǎn)染mir-143-3pmimics/inhibitors到不同胃癌細(xì)胞,通過cck-8方法檢測細(xì)胞增殖的變化,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化,采用transwell小室檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測mir-143-3p下游可能的靶基因,采用免疫組化方法檢測胃癌組織靶基因的表達(dá),分析mir-143-3p和靶基因的相關(guān)性,體外研究轉(zhuǎn)染mir-143-3pmimics/inhibitors到不同胃癌細(xì)胞,采用qrt-pcr檢測靶基因mrna的變化,采用westernblot檢測靶蛋白的變化。通過轉(zhuǎn)染靶基因特異性的sirna下調(diào)靶基因的表達(dá),分析細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的變化。結(jié)果(1)經(jīng)免疫組化檢測,188例(72.0%)患者h(yuǎn).pylori陽性,73例(28.0%)h.pylori陰性。h.pylori感染與年齡、生存情況和復(fù)發(fā)情況相關(guān)。(2)h.pylori陽性胃癌患者術(shù)后平均os為55.2個月(95%ci=53.4~56.9),較h.pylori陰性胃癌患者45.1個月(95%ci=42.2~47.9)延長。h.pylori陽性胃癌患者術(shù)后平均dfs為53.9個月(95%ci=51.8~56.0),較h.pylori陰性胃癌患者43.7個月(95%ci=40.4~47.0)延長。經(jīng)cox多因素分析結(jié)果仍顯示h.pylori陽性患者有更長的os(hr=0.485,95%ci=0.265~0.889,p=0.019)。(3)采用芯片比較h.pylori陽性和陰性的胃癌組織mirna表達(dá)情況,結(jié)果顯示共有43個mirnas存在顯著差異表達(dá)。相對于h.pylori陰性的胃癌組織,在h.pylori陽性的胃癌組織上有5個mirnas顯著上調(diào),38個mirnas顯著下調(diào)。進(jìn)一步通過qrt-pcr驗證結(jié)果示:mir-100-5p,mir-143-3p和mir-145-5p在h.pylori陽性胃癌組織的表達(dá)水平分別是h.pylori陰性胃癌組織的1.24倍,2.1倍和1.64倍,mir-4514在h.pylori陰性胃癌組織的表達(dá)水平是h.pylori陽性胃癌組織的2.13倍,與芯片結(jié)果趨勢一致。(4)同時采用芯片比較h.pylori陽性和h.pylori陰性的癌旁組織mirna表達(dá)情況,結(jié)果顯示共有7個mirnas存在明顯差異表達(dá)。相對于h.pylori陰性的癌旁組織,在h.pylori陽性的癌旁組織上有2個mirnas顯著上調(diào),5個mirnas顯著下調(diào)。通過qrt-pcr進(jìn)一步驗證結(jié)果示:mir-148a-3p,mir-30b-5p和mir-26b-5p在h.pylori陽性癌旁組織的表達(dá)水平分別是h.pylori陰性癌旁組織的1.71倍,1.30倍和1.25倍,與芯片結(jié)果趨勢一致。(5)mir-143-3p在73.8%(31/42)的胃癌組織中表達(dá)水平顯著下調(diào),mir-143-3p的低表達(dá)與更晚的分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。與正常胃上皮細(xì)胞ges-1相比,mir-143-3p在胃癌細(xì)胞sgc-7901、hgc-27、mgc-803、ags、mkn-45、bgc-823中的表達(dá)均顯著下調(diào)(p0.001)。體外選取內(nèi)源性mir-143-3p表達(dá)水平最高的sgc-7901細(xì)胞和相對最低的bgc-823細(xì)胞作為一對模型細(xì)胞,來進(jìn)行后續(xù)功能學(xué)實驗。對bgc-823細(xì)胞,上調(diào)mir-143-3p的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;對sgc-7901細(xì)胞,下調(diào)mir-143-3p的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,抑制細(xì)胞凋亡。(6)經(jīng)生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測,rictor和akt2是mir-143-3p可能的靶基因,檢測42例胃癌組織及癌旁組織rictor和akt2的表達(dá),rictor在胃癌組織陽性率為50.2%,在癌旁組織陽性率為26.8%;akt2在胃癌組織陽性率為71.4%,在癌旁組織陽性率為23.8%。rictor的表達(dá)與mir-143-3p呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=-0.340,p=0.028;akt2的表達(dá)與mir-143-3p也呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=-0.422,p=0.005。(7)轉(zhuǎn)染mir-143-3pmimics使胃癌細(xì)胞bgc-823內(nèi)源性rictormrna和蛋白的表達(dá)顯著下調(diào),轉(zhuǎn)染mir-143-3pinhibitor可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞sgc-7901rictormrna和蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。類似的,轉(zhuǎn)染mir-143-3pmimics可以下調(diào)bgc-823細(xì)胞內(nèi)源性akt2mrna和蛋白的表達(dá)水平,轉(zhuǎn)染mir-143-3pinhibitor可以上調(diào)sgc-7901細(xì)胞內(nèi)源性akt2mrna和蛋白的表達(dá)水平。(8)轉(zhuǎn)染rictor和akt2特異性sirna干擾rictor和akt2表達(dá),均可抑制bgc-823和sgc-7901胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。結(jié)論(1)h.pylori在癌旁組織表達(dá)高于胃癌組織,總體陽性率為72.0%;h.pylori感染與胃癌患者年齡有關(guān),低齡患者其h.pylori感染更為常見。h.pylori陽性胃癌患者術(shù)后os優(yōu)于陰性患者,h.pylori感染是行根治性切除胃癌患者的獨立、有利預(yù)后因素。h.pylori陰性的胃癌患者術(shù)后需要更嚴(yán)格的隨訪與更積極的抗腫瘤治療。(2)h.pylori陽性和陰性的胃癌組織共有43個mirnas存在顯著差異表達(dá),經(jīng)qrt-pcr驗證,mir-100-5p,mir-143-3p和mir-145-5p在h.pylori陽性胃癌組織的表達(dá)明顯上調(diào),mir-4514在h.pylori陽性胃癌組織的表達(dá)明顯下調(diào)。(3)h.pylori陽性和陰性的癌旁組織共有7個mirnas存在明顯差異表達(dá),經(jīng)qrt-pcr驗證,mir-148a-3p,mir-30b-5p和mir-26b-5p在h.pylori陽性的癌旁組織的表達(dá)明顯上調(diào)。(4)mir-143-3p在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中均為低表達(dá),其表達(dá)水平與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。過表達(dá)mir-143-3p可抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。(5)生物信息學(xué)分析預(yù)測Rictor和AKT2是miR-143-3p可能的靶基因,Rictor和AKT2在胃癌組織顯著高表達(dá),且表達(dá)水平與miR-143-3p呈負(fù)相關(guān)。miR-143-3p可負(fù)向調(diào)控胃癌細(xì)胞中Rictor及AKT2 mRNA和蛋白表達(dá)水平。下調(diào)Rictor和AKT2的表達(dá),可抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡,發(fā)揮與miR-143-3p mimics類似的功能。(6)miR-143-3p通過調(diào)控Rictor和AKT2基因發(fā)揮抑癌基因的作用,有待熒光素酶報告實驗來進(jìn)一步證實。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 幽門螺桿菌 微小 RNA 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-8
• 中文摘要8-13
• 英文摘要13-19
• 研究背景19-25
• 參考文獻(xiàn)22-25
• 研究之一 幽門螺桿菌感染對胃癌預(yù)后的影響25-45
• 1 引言25-27
• 2 對象和方法27-30
• 3 結(jié)果30-35
• 4 討論35-39
• 5 結(jié)論39-40
• 6 參考文獻(xiàn)40-45
• 研究之二 幽門螺桿菌陽性和陰性的胃癌組織miRNA差異表達(dá)譜的研究45-74
• 1 引言45-47
• 2 對象和方法47-52
• 3 結(jié)果52-62
• 4 討論62-66
• 5 結(jié)論66-67
• 6 參考文獻(xiàn)67-74
• 研究之三 miR-143-3p對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制74-118
• 1 引言74-76
• 2 對象和方法76-87
• 3 結(jié)果87-109
• 4 討論109-113
• 5 結(jié)論113-114
• 6 參考文獻(xiàn)114-118
• 附錄118-120
• 致謝120-122
• 綜述122-150
• 參考文獻(xiàn)141-150

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本文編號：491958