本文關(guān)鍵詞：H9N2亞型禽流感病毒在豚鼠模型中水平傳播的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在禽類中廣泛流行的H9N2亞型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)已經(jīng)引起多例感染人的事件。血清學(xué)調(diào)查表明,我國(guó)部分禽類從業(yè)者中H9亞型AIV抗體陽(yáng)性率可達(dá)2.3%~13.7%。人感染H9N2亞型AIV后表現(xiàn)的癥狀與感染季節(jié)性流感病毒相似而容易被人忽視,增加了其在人體內(nèi)適應(yīng)突變的機(jī)率,更重要的是部分病毒株已經(jīng)具有結(jié)合人樣流感病毒受體的能力。本研究中,我們選擇1株H9N2亞型AIV分別在哺乳動(dòng)物模型(小鼠和豚鼠)體內(nèi)連續(xù)適應(yīng)后評(píng)價(jià)其適應(yīng)病毒株的致病力和傳播能力,并初步探索影響這些改變的分子機(jī)制。已有研究表明,H5N1亞型AIV和H7N1亞型AIV能夠通過(guò)在雪貂體內(nèi)連續(xù)傳代而獲得高效的傳播能力。本研究中,我們?cè)u(píng)價(jià)A/Chicken/Shandong/Li-2/2010(H9N2)(簡(jiǎn)稱SD2)病毒株能否通過(guò)在豚鼠體內(nèi)連續(xù)傳代后獲得水平傳播能力。適應(yīng)9代后,病毒株獲得了在豚鼠中接觸傳播能力(2/3),15代后接觸傳播能力進(jìn)一步增加(3/3)。利用反向遺傳技術(shù)對(duì)15代病毒株進(jìn)行逐一突變后,發(fā)現(xiàn)3個(gè)氨基酸突變(HA1-Q227P、HA2-D46E和NP-E434K)決定H9N2亞型AIV的接觸傳播能力(2/3)。HA蛋白的兩個(gè)突變位點(diǎn)能增加病毒對(duì)禽樣受體的結(jié)合能力。HA2-D46E能夠增強(qiáng)病毒的熱穩(wěn)定性;NP-E434K能夠顯著增強(qiáng)病毒體外的聚合酶活性。除了上述3個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)外,我們還發(fā)現(xiàn)PB2-D195N對(duì)SD2病毒株的傳播有一定的協(xié)同作用。SD2病毒株能夠通過(guò)在豚鼠中適應(yīng)而獲得傳播能力,為了比較宿主差異對(duì)流感病毒適應(yīng)突變的影響,我們將SD2病毒株同樣在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代而得到小鼠適應(yīng)病毒株。5代后小鼠適應(yīng)病毒株的致病力比母本病毒株提高1000倍,并且獲得3個(gè)氨基酸突變(HA-N313D/N496S和PB2-E627K)。HA-N313D/N496S能夠增加病毒對(duì)人樣受體的結(jié)合能力,而PB2-E627K能夠增強(qiáng)病毒的體外聚合酶活性。進(jìn)一步,我們?cè)u(píng)價(jià)這株小鼠適應(yīng)病毒株能否像豚鼠適應(yīng)病毒株一樣在豚鼠中的傳播,3只接觸組豚鼠的鼻洗液中都沒(méi)有檢測(cè)到流感病毒。結(jié)果表明SD2病毒株在小鼠體內(nèi)獲得的受體結(jié)合能力的增強(qiáng)和聚合酶活性的增加不能使其獲得在豚鼠中的傳播能力。聚合酶蛋白影響流感病毒的在宿主中復(fù)制及傳播能力。上文中我們發(fā)現(xiàn)PB2-D195N協(xié)同SD2病毒株在豚鼠中的傳播。通過(guò)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢,我們發(fā)現(xiàn)PB2-195N存在于多個(gè)亞型禽流感病毒中,并且與PB2-627K共同存在于少數(shù)H5N1流感病毒中。因此,我們將這兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)引入SD2病毒株中并評(píng)價(jià)其在豚鼠中的傳播能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這株突變病毒獲得了在豚鼠中的接觸傳播能力(3/3)。不僅如此,這兩個(gè)氨基酸突變同時(shí)擴(kuò)大了SD2病毒株在小鼠體內(nèi)的組織嗜性。我們的研究結(jié)果表明,病毒在不同哺乳動(dòng)物宿主中適應(yīng)后傳播能力與致病能力的變化不同,宿主差異會(huì)影響病毒的進(jìn)化方向。3個(gè)氨基酸的適應(yīng)性突變(HA1-Q227P、HA2-D46E和NP-E434K)就可以使H9N2亞型AIV獲得在豚鼠中接觸傳播的能力(2/3),而決定病毒致病性的PB2-627K與PB2-195N協(xié)同作用后會(huì)使病毒獲得在豚鼠中的接觸傳播能力(3/3)。進(jìn)一步的分子機(jī)制分析表明,病毒受體結(jié)合特性與聚合酶活性決定病毒的傳播能力。本研究豐富對(duì)H9N2亞型流感病毒的認(rèn)知,對(duì)大流行流感的預(yù)警也具有重要參考價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：H9N2 AIV 豚鼠模型 水平傳播 受體結(jié)合能力 聚合酶活性
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R511.7;R-332
【目錄】：

• 附表3-6
• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文縮略表13-14
• 第一章 引言14-28
• 1.1 20世紀(jì)人類歷史上5次流感病毒的大流行14-15
• 1.1.1“西班牙”H1N1流感大流行14
• 1.1.2 亞洲H2N2流感大流行14
• 1.1.3“香港”H3N2流感大流行14-15
• 1.1.4 H1N1的再次出現(xiàn)15
• 1.1.52009甲型H1N1流感大流行15
• 1.2 H5、H7和H9亞型AIVs在哺乳動(dòng)物模型中水平傳播研究進(jìn)展15-17
• 1.2.1 H5N1亞型禽流感病毒15-16
• 1.2.2 H9N2亞型禽流感病毒16-17
• 1.2.3 H7N9亞型禽流感病毒17
• 1.3 流感病毒從動(dòng)物到人的傳播屏障17-20
• 1.3.1 野禽到人傳播的障礙18-19
• 1.3.2 流感病毒跨種傳播的途徑19-20
• 1.3.3 傳染路徑的屏障20
• 1.4 病毒和細(xì)胞間相互作用的屏障20-24
• 1.4.1 病毒與宿主細(xì)胞的吸附21-22
• 1.4.2 病毒和細(xì)胞融合22-23
• 1.4.3 病毒的復(fù)制23-24
• 1.4.4 病毒的釋放24
• 1.5 流感病毒在人群中適應(yīng)的分子機(jī)制和進(jìn)化途徑24-26
• 1.5.1 病毒復(fù)制過(guò)程中的基因突變24-26
• 1.5.2 不同亞型病毒基因重組26
• 1.6 本研究的目的與意義26-28
• 第二章 H9N2 AIV在豚鼠中傳播的分子機(jī)制初步研究28-47
• 2.1 材料與方法28-34
• 2.1.1 病毒株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28-29
• 2.1.2 細(xì)胞、菌株與載體29
• 2.1.3 主要試劑29
• 2.1.4 主要儀器29
• 2.1.5 病毒RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增29-30
• 2.1.6 PCR膠回收方法及質(zhì)粒提取方法30-31
• 2.1.7 點(diǎn)突變方法及突變引物的設(shè)計(jì)31
• 2.1.8 流感病毒受體檢測(cè)方法31-32
• 2.1.9 流感病毒聚合酶復(fù)合體活性的測(cè)定32
• 2.1.10 流感病毒HA蛋白熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性檢測(cè)32
• 2.1.11 SD2/H9N2病毒株及突變病毒株的拯救32-33
• 2.1.12 H9N2亞型AIV對(duì)小鼠致病力評(píng)估33
• 2.1.13 H9N2亞型AIV在豚鼠模型中接觸傳播能力的評(píng)估33
• 2.1.14 SD2豚鼠適應(yīng)病毒株在豚鼠模型和雪貂模型間的氣源性傳播能力評(píng)估33
• 2.1.15血清抗體檢測(cè)33-34
• 2.2 結(jié)果34-45
• 2.2.1 3株H9N2亞型AIVs對(duì)小鼠致病力及HA受體結(jié)合能力的評(píng)估34-35
• 2.2.2 3株H9N2亞型AIVs在豚鼠模型中接觸傳播能力的評(píng)估35-36
• 2.2.3 SD2病毒株通過(guò)在豚鼠體內(nèi)適應(yīng)性傳代而獲得接觸傳播能力36-37
• 2.2.4 SD2/H9N2豚鼠傳代病毒株與母本病毒株全基因序列的比較分析37-38
• 2.2.5 影響豚鼠適應(yīng)病毒株在豚鼠模型中接觸傳播的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的確定38-39
• 2.2.6 HA1-Q227P和HA2-D46E氨基酸突變改變病毒受體結(jié)合能力39-40
• 2.2.7 HA2-D46E增加病毒HA蛋白的熱穩(wěn)定性40-41
• 2.2.8 HA1-Q227P能夠降低病毒HA蛋白的酸穩(wěn)定性41-42
• 2.2.9 NP-E434K能增顯著增加在 33℃條件下的病毒聚合酶活性42-43
• 2.2.10 P15代豚鼠適應(yīng)病毒株在豚鼠模型和雪貂模型中氣源傳播的效率較低43-45
• 2.2.11豚鼠適應(yīng)傳代病毒株對(duì)小鼠致病力評(píng)估及抗原性分析45
• 2.3 討論45-47
• 第三章 SD2小鼠適應(yīng)病毒株在豚鼠模型中的傳播能力評(píng)估47-58
• 3.1 材料與方法47-52
• 3.1.1 病毒株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物47
• 3.1.2 細(xì)胞、菌株與載體47-48
• 3.1.3 主要試劑48
• 3.1.4 主要儀器48
• 3.1.5 病毒RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增48-49
• 3.1.6 PCR膠回收方法及質(zhì)粒提取方法49
• 3.1.7 點(diǎn)突變引物的設(shè)計(jì)49-50
• 3.1.8 SD2病毒株及突變病毒株的拯救50
• 3.1.9 SD2病毒株在小鼠體內(nèi)的適應(yīng)性傳代50
• 3.1.10 小鼠致病力評(píng)估實(shí)驗(yàn)50-51
• 3.1.11 SD2小鼠適應(yīng)病毒株在豚鼠模型中的傳播能力評(píng)估51
• 3.1.12 SD2小鼠適應(yīng)病毒株受體結(jié)合能力檢測(cè)51
• 3.1.13 SD2小鼠適應(yīng)株病毒株體外聚合酶活性檢測(cè)51-52
• 3.1.14 血清抗體的檢測(cè)52
• 3.2 結(jié)果52-56
• 3.2.1 P5小鼠適應(yīng)病毒株對(duì)小鼠的致病力增加52-53
• 3.2.2 P5小鼠適應(yīng)病毒株對(duì) α2,6-糖苷鍵SA結(jié)合能力增強(qiáng)53-54
• 3.2.3 PB2-E627K顯著增加病毒的體外聚合酶活性54-55
• 3.2.4 P5小鼠適應(yīng)病毒株不能在豚鼠模型中發(fā)生傳播55-56
• 3.3 討論56-58
• 第四章 PB2-D195N和PB2-E627K有助于SD2病毒株在豚鼠中的傳播58-68
• 4.1 材料與方法58-62
• 4.1.1 病毒株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物58
• 4.1.2 細(xì)胞、菌株與載體58
• 4.1.3 主要試劑58-59
• 4.1.4 主要儀器59
• 4.1.5 病毒RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增59-60
• 4.1.6 PCR膠回收方法及質(zhì)粒提取方法60
• 4.1.7 點(diǎn)突變引物的設(shè)計(jì)及突變病毒株的拯救60
• 4.1.8 流感病毒聚合酶復(fù)合體活性的測(cè)定60-61
• 4.1.9 小鼠致病力評(píng)估實(shí)驗(yàn)61
• 4.1.10豚鼠模型間傳播能力評(píng)估61
• 4.1.11血清抗體的檢測(cè)61-62
• 4.2 結(jié)果62-66
• 4.2.1 PB2-D195N不能協(xié)同增強(qiáng)PB2-E627K對(duì)SD2病毒體外聚合酶活性62-63
• 4.2.2 PB2-D195N和PB2-E627K能夠增加SD2病毒株在小鼠體內(nèi)的組織嗜性63-65
• 4.2.3 PB2-D195N和PB2-E627K有助于SD2病毒株在豚鼠中發(fā)生接觸傳播65-66
• 4.3 討論66-68
• 第五章 全文結(jié)論68-69
• 參考文獻(xiàn)69-77
• 致謝77-78
• 作者簡(jiǎn)歷78

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  本文關(guān)鍵詞：H9N2亞型禽流感病毒在豚鼠模型中水平傳播的分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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