本文關(guān)鍵詞：水蛭DNA鑒定、活性多肽分離及其作用機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：廣義水蛭通常是指環(huán)節(jié)動(dòng)物門(Annelida)蛭綱(Hirudinea)一類動(dòng)物的總稱。作為中藥,從《神農(nóng)本草經(jīng)》開始記載使用,迄今已有3000多年的歷史。中醫(yī)對(duì)瘀血的定義是指體內(nèi)血液停積而形成的病理產(chǎn)物,凡能影響血液正常運(yùn)行,引血液運(yùn)行不暢,致血離經(jīng)脈而瘀積的內(nèi)外因素,均可導(dǎo)致瘀血形成。中醫(yī)論述水蛭的性味、功效和主治為:味咸平,可破血、逐瘀、通經(jīng),治蓄血、癥瘕積聚、婦女經(jīng)閉、干血成癆、跌撲損傷等證。水蛭的功效與其抗凝血作用密切相關(guān)。凝血是機(jī)體重要的生理防御過程,但病理性凝血即血栓形成導(dǎo)致血行不暢,在心腦血管疾病的惡化中起著關(guān)鍵的作用,因此,抗血栓和抗凝血是治療心腦血管疾病的重要方法之一。水蛭中發(fā)現(xiàn)的最重要的、療效最好的抗凝血活性物質(zhì)是水蛭素(Hirudin),水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凝血酶抑制劑。水蛭作為中藥,中醫(yī)臨床使用歷史悠久,其活血化瘀功效確切,但仍有很多中醫(yī)藥用的基礎(chǔ)理論問題尚未研究清楚。如1、藥用品種問題。中國藥典中藥水蛭的來源僅有三種,廣義水蛭是環(huán)節(jié)動(dòng)物門蛭綱動(dòng)物的總稱,有什么較好的辦法能將形態(tài)類似的動(dòng)物加以區(qū)分,以保證中藥水蛭的品種來源及臨床療效?2、療效藥用物質(zhì)基礎(chǔ)問題。水蛭素等活性物質(zhì)只能在活體的日本醫(yī)蛭分泌物中提取,干燥和加熱后就會(huì)受到破壞。而中醫(yī)臨床藥用水蛭使用其干燥體,用水煎煮甚至炮制后服用,這是否還具有活血化瘀或抗凝血作用?在不吸血的寬體金線蛭中并不含水蛭素,寬體金線蛭作為中藥水蛭的主流商品,是否含有抗凝血的活性物質(zhì)?其抗凝血活性成分有哪些?其抗凝血作用機(jī)制與哪些因素相關(guān)?3、資源緊張問題。近年來市場(chǎng)需求不斷上漲,中藥水蛭尤其是日本醫(yī)蛭的資源極度緊缺,究竟古代藥用水蛭品種與現(xiàn)代藥用品種有什么不同?什么水蛭的品種可作為新的水蛭資源品種進(jìn)行替代研究?4、質(zhì)量評(píng)價(jià)問題�？鼓钚允侵兴幩位钛龉πУ乃幚韺W(xué)基礎(chǔ),但目前中國藥典中水蛭抗凝血活性的測(cè)定方法穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性欠佳,期待尋找更為合理的方法用于檢測(cè)水蛭藥材的抗凝血活性,以確保其臨床療效。這些都是中藥水蛭在臨床應(yīng)用中所亟待解決的中醫(yī)基礎(chǔ)理論問題。為研究上述問題,本文在不同物種水蛭的分子生物學(xué)鑒定;在寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭及菲牛蛭抗凝活性成分的分析、分離及鑒定;在寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭及菲牛蛭的抗凝血體外作用機(jī)制初探;在抗凝血活性的生物檢定等方面,進(jìn)行了廣泛而深入的研究。通過研究,發(fā)現(xiàn)了一些新的抗凝血活性肽及其作用機(jī)制,尤其在寬體金線蛭的研究方面,較前人有較多新的進(jìn)展。采用分子生物學(xué)技術(shù),擴(kuò)增得到寬體金線蛭、菲牛蛭、日本醫(yī)蛭、尖細(xì)金線蛭、光潤金線蛭、棒紋牛蛭、日本山蛭及八目石蛭等8個(gè)物種的ITS2、COⅠ、12Sr RNA、16Sr RNA等基因片斷的序列,比較此4個(gè)基因片斷候選序列種內(nèi)種間差異;利用Wilcoxon Two Sample Tests檢驗(yàn),考察候選序列種間、種內(nèi)變異的barcoding gap;并結(jié)合鑒定成功率,得到12Sr RNA為醫(yī)用蛭類較為合適的DNA條形碼序列。并提出應(yīng)用COⅠ及12Sr RNA聯(lián)合序列在種內(nèi)保守而種間差異較大的片段設(shè)計(jì)特異引物,是準(zhǔn)確鑒別水蛭藥材真?zhèn)蔚睦硐敕椒�。采用凝膠柱色譜聯(lián)合制備高效液相色譜的方法,依據(jù)中醫(yī)臨床的使用特點(diǎn),首次從寬體金線蛭中分離得到一個(gè)耐熱、具抗凝血活性的多肽成分,分子量為9374,并分析其含分子量為1832的糖鏈,屬于糖肽類化合物,對(duì)寬體金線蛭藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有了初步的闡釋。用液質(zhì)聯(lián)用的方法,對(duì)日本醫(yī)蛭及菲牛蛭中抗凝血活性多肽類成分進(jìn)行了研究,分析得到日本醫(yī)蛭3個(gè)多肽類成分,分子量為14998、15988、15956;菲牛蛭中分析得到6個(gè)多肽類成分,9590、13642、14998、17631、15988、16567。其中日本醫(yī)蛭與菲牛蛭有兩個(gè)成分具有相同的分子量,且此兩成分為活性多肽部位主要的成分峰。從活性成分角度而言,菲牛蛭作為水蛭新來源是完全可以的。用胰蛋白酶酶切結(jié)合Marker Lnyx軟件分析的方法,找到日本醫(yī)蛭與菲牛蛭區(qū)別的特征識(shí)別肽。采用體外培養(yǎng)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用的方法,分析了寬體金線蛭與凝血酶、凝血因子Ⅶ以及凝血因子Ⅸ的作用,初步認(rèn)為寬體金線蛭抗凝血作用位點(diǎn)與凝血因子Ⅶ有關(guān);對(duì)比了寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭、菲牛蛭及棒紋牛蛭與凝血酶的作用,認(rèn)為后三者均與凝血酶有作用,但寬體金線蛭抗凝血作用位點(diǎn)是與凝血酶、凝血因子Ⅶ等多個(gè)位點(diǎn)相關(guān),體現(xiàn)了水蛭作用多靶點(diǎn)整體性的特點(diǎn),這一特點(diǎn)既符合中醫(yī)整體觀念,又符合中藥多成分多靶點(diǎn)作用模式。將生物檢定技術(shù)應(yīng)用于水蛭抗凝血活性的測(cè)定,探討反映水蛭生物活性的質(zhì)量控制方法。采用肝素鈉作為對(duì)照品,選擇APTT值作為抗凝活性評(píng)價(jià)依據(jù),對(duì)寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭、菲牛蛭、棒紋牛蛭的抗凝活性進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果分別用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和生物檢定統(tǒng)計(jì)法計(jì)算。4種水蛭APTT法的量效關(guān)系曲線與肝素的量效關(guān)系曲線類似,突躍范圍呈平行關(guān)系,上述特點(diǎn)符合生物檢定的要求,說明以肝素鈉作為標(biāo)準(zhǔn)品,采用生物檢定技術(shù)APTT法測(cè)定水蛭等樣品的抗凝活性是可行的。APTT值可以全面反映水蛭的抗凝血作用,測(cè)定結(jié)果對(duì)臨床使用更具指導(dǎo)意義。生物檢定技術(shù)應(yīng)用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià),符合中醫(yī)整體作用、協(xié)同作用的觀點(diǎn),是對(duì)現(xiàn)有中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制方法良好的補(bǔ)充。本文通過研究,整合DNA分子標(biāo)記技術(shù)、LC-MS色譜聯(lián)用技術(shù)、生物檢定技術(shù)等現(xiàn)代分析手段,使用各種計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)作數(shù)據(jù)分析處理,分別從鑒定、分離、分析、質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面構(gòu)建了含動(dòng)物活性多肽類的中藥研究的先進(jìn)技術(shù)平臺(tái),為動(dòng)物類中藥的研究建立了一個(gè)系統(tǒng)研究的模式;突出了生物檢測(cè)技術(shù)作為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制的發(fā)展方向,采用同一APTT法評(píng)價(jià)不同活性強(qiáng)度不同水蛭品種的抗凝活性,解決了水蛭原有的凝血酶滴定法對(duì)不同品種測(cè)定評(píng)價(jià)方法不統(tǒng)一的弊端;發(fā)現(xiàn)菲牛蛭含有與水蛭類似的活性多肽,可考慮作為醫(yī)用水蛭資源新品種,緩解水蛭資源問題等。這一系列工作將為水蛭的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ),并很好的闡述了水蛭的品種鑒定、藥源替代、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論問題。
【關(guān)鍵詞】：水蛭 DNA條形碼 寬體金線蛭 日本醫(yī)蛭 菲牛蛭 棒紋牛蛭 多肽 抗凝血活性 APTT 生物檢定
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R284
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 縮略詞中英文對(duì)照15-16
• 前言16-19
• 第一部分 醫(yī)用水蛭DNA條形碼鑒定研究19-41
• 1 材料與方法21-32
• 1.1 水蛭養(yǎng)殖基地及資源分布21-22
• 1.2 樣品采集22-24
• 1.3 樣品鑒定24-26
• 1.4 儀器與試藥26-27
• 1.5 總DNA提取及濃度測(cè)定27-28
• 1.6 PCR擴(kuò)增28-30
• 1.7 PCR產(chǎn)物測(cè)序30-31
• 1.8 序列分析31-32
• 2 結(jié)果32-37
• 2.1 序列信息、PCR擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率32-33
• 2.2 不同DNA條形碼候選序列種內(nèi)種間差異分析33-34
• 2.3 不同DNA條形碼候選序列barcoding gap檢驗(yàn)34-37
• 2.4 DNA條形碼候選序列鑒定效率評(píng)價(jià)37
• 3 討論37-39
• REFERENCES39-41
• 第二部分 寬體金線蛭抗凝血活性多肽的分離鑒定41-61
• 1 儀器與試藥41-42
• 2 方法與結(jié)果42-60
• 2.1 寬體金線蛭提取物活性分析42-44
• 2.2 樣品提取液的LC-MS分析44-48
• 2.3 寬體金線蛭多肽I的分離48-54
• 2.4 寬體金線蛭多肽I的結(jié)構(gòu)分析54-60
• 3 討論60
• REFERENCES60-61
• 第三部分 日本醫(yī)蛭與菲牛蛭多肽類成分分析61-72
• 1 儀器與試藥61
• 2 方法與結(jié)果61-70
• 2.1 供試品溶液的制備61-62
• 2.2 樣品胰蛋白酶解62
• 2.3 LC-MS條件62
• 2.4 樣品的TOF-MS結(jié)果62-66
• 2.5 樣品胰酶酶解液的LC-MS分析66-70
• 3 討論70-71
• REFERENCES71-72
• 第四部分 寬體金線蛭活性多肽部位抗凝血作用機(jī)理初探72-95
• 1 儀器與試藥73
• 2 方法與結(jié)果73-92
• 2.1 供試品溶液的制備73
• 2.2 色譜條件73-74
• 2.3. 凝血酶（凝血因子Ⅱ衍生物）分析試驗(yàn)74-78
• 2.4 凝血因子Ⅶ作用分析試驗(yàn)78-83
• 2.5 凝血因子Ⅸ作用分析試驗(yàn)83-88
• 2.6 日本醫(yī)蛭、菲牛蛭、棒紋牛蛭凝血酶反應(yīng)分析試驗(yàn)88-92
• 3 小結(jié)和討論92-94
• REFERENCES94-95
• 第五部分 生物檢定技術(shù)應(yīng)用于水蛭抗凝血活性測(cè)定95-118
• 1 儀器與試藥96
• 2 方法與結(jié)果96-115
• 2.1 樣品溶液的制備96-97
• 2.2 肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備97
• 2.3 APTT值測(cè)定方法97
• 2.4 測(cè)定結(jié)果97-99
• 2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算水蛭效價(jià)99-100
• 2.6 量反應(yīng)平行線法計(jì)算水蛭效價(jià)100-102
• 2.7 兩種計(jì)算方法比較102
• 2.8 兩種測(cè)定方法結(jié)果比較102-103
• 2.9 APTT效價(jià)測(cè)定法方法學(xué)驗(yàn)證103-115
• 3 討論115-116
• REFERENCE116-118
• 綜述——水蛭藥用資源研究概況與思考118-135
• 1 本草考證118-119
• 2 藥源品種與分布119-120
• 3 炮制學(xué)研究120-122
• 3.1 水蛭古代的炮制方法121
• 3.2 水蛭現(xiàn)代炮制121-122
• 4 品種分類與鑒定122-123
• 5 活性成分研究123-124
• 6 藥理作用124-126
• 6.1 水蛭素的藥理作用124-125
• 6.2 水蛭藥材的藥理作用125-126
• 6.3 毒、副作用126
• 7 臨床應(yīng)用126-127
• 8 分析與討論127-129
• 8.1 水蛭藥源問題127-128
• 8.2 活性成分問題128
• 8.3 商品市場(chǎng)問題128-129
• REFERENCE129-135
• 結(jié)語與展望135-137
• 附錄137-138
• 致謝138-139

  本文關(guān)鍵詞：水蛭DNA鑒定、活性多肽分離及其作用機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：442424