本文關(guān)鍵詞：SRY在動脈粥樣硬化和Tirofiban在腎缺血再灌注中的作用機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)胞外微泡(extracellular vesicles,EVs)是一類體積較小的膜囊泡。,是從細(xì)胞膜表面脫落產(chǎn)生的囊泡,具有雙層脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞膜,胞漿和部分蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)。EVs包括外泌體(exosomes)和脫落囊泡兩類,前者為細(xì)胞胞吐作用產(chǎn)生的多胞體,后者由細(xì)胞出芽生殖產(chǎn)生。既往的研究認(rèn)為EVs是不具有功能的細(xì)胞塵埃,但是大量近期研究表明,它是一種重要的細(xì)胞交流載體,具有重要的生物學(xué)功能。本實(shí)驗室的前期研究表明,微泡中存在的DNA可以通過胞吞作用或膜融合從一個細(xì)胞進(jìn)入另一個細(xì)胞。利用微泡轉(zhuǎn)運(yùn)的DNA進(jìn)入新的細(xì)胞之后可以融合進(jìn)入接受細(xì)胞的基因組,編碼相應(yīng)的mRNA和蛋白質(zhì)。但是,微泡DNA在疾病中發(fā)揮的病理作用尚不完全清楚�，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)微泡在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用,參與了腫瘤細(xì)胞的浸潤和遠(yuǎn)處播散。腫瘤細(xì)胞來源的微泡可以使正常細(xì)胞表現(xiàn)出癌變的表型。除腫瘤以外,微泡也參與多種疾病的發(fā)病過程。越來越多的證據(jù)顯示,通過細(xì)胞間通訊,微泡調(diào)節(jié)血小板的黏附性以及白細(xì)胞和內(nèi)皮的相互連接,參與了動脈粥樣硬化的病理過程。但是否微泡中DNA參與了這一過程,尚不清楚。另一方面,Y染色體,除了是保證男性特征的重要因素以外,在心血管疾病中發(fā)病的作用也越來越引起研究者的重視。一些研究發(fā)現(xiàn)Y染色體上的一重要基因SRY(sex determining region,Y;即Y染色體性別決定域)對增加血管緊張素Ⅱ和去甲腎上腺素水平具有調(diào)節(jié)作用。而男性多體性的Y染色體(大部分為XYY核型)可顯著的增加冠心病的發(fā)病風(fēng)險。而微泡中是否含有SRY基因DNA,該DNA是否參與了動脈粥樣硬化的病理過程,尚不清楚。因此,本研究擬以人群研究、實(shí)驗動物分析及細(xì)胞實(shí)驗為研究方法,分析血中游離微泡所含SRY DNA對白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的影響及其在動脈粥樣硬化病理過程中的作用機(jī)制。1.1研究方法1.1.1分析男性冠心病患者srydna基因拷貝數(shù)(genecopynumber,gcn)的變化情況本部分實(shí)驗以正常男性及男性冠心病患者的血液樣本為研究對象,利用pcr、dna測序技術(shù)、實(shí)時定量pcr和免疫印跡法等技術(shù)手段,分析srydna基因拷貝數(shù)的在不同人群的改變情況。1.1.2研究微泡中srydna的轉(zhuǎn)移性及功能本部分實(shí)驗構(gòu)建sry-hek293細(xì)胞株,分析sry-hek293來源的微泡對單核細(xì)胞黏附蛋白cd11-a及內(nèi)皮細(xì)胞黏附蛋白icam-1表達(dá)的作用,sry蛋白對cd11-a及icam-1基因啟動子的調(diào)控作用,sry微泡對單核細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞粘附的作用。1.1.3研究微泡中srydna對apoe敲除小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生的作用。本部分實(shí)驗將利用apoe敲除小鼠,分析sry微泡對小鼠動脈粥樣硬化的影響,以及對小鼠單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞粘附蛋白cd11-a及icam-1表達(dá)的影響。1.2研究結(jié)果1.2.1在該部分實(shí)驗中,我們首先證實(shí)了男性血漿微泡中存在srydna,且男性冠心病人血漿微泡中sry基因拷貝數(shù)顯著的高于正常男性。而男性冠心病患者白細(xì)胞sry的基因拷貝數(shù)、mrna表達(dá)及蛋白表達(dá)同樣均顯著的高于來源于正常男性的白細(xì)胞(p0.05)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),男性冠心病患者白細(xì)胞上黏附因子cd11-a的蛋白表達(dá)顯著的高于對照人群(p0.05)。1.2.2為分析微泡中srydna的功能,本實(shí)驗首先構(gòu)建了表達(dá)sry基因的hek293細(xì)胞并對該細(xì)胞系微泡中的srydna進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,sry-hek293細(xì)胞分泌微泡中存在srydna及蛋白的表達(dá)。sry微泡可顯著的增高單核細(xì)胞粘附因子cd11-a及內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子icam-1的蛋白表達(dá)(p0.05)。sry蛋白與cd11-a及icam-1啟動子均有結(jié)合,提示sry對cd11-a及icam-1的調(diào)節(jié)作用存在于轉(zhuǎn)錄水平,并進(jìn)一步增加了thp-1細(xì)胞與huvecs細(xì)胞的粘附作用(p0.05)。1.2.3進(jìn)一步的實(shí)驗在動物水平驗證之前的結(jié)構(gòu)。利用血管組織的油紅o染色及組織h/e染色,對斑塊形成情況進(jìn)行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn):使用sry微泡注射可顯著增大動脈粥樣斑塊的面積,加重血管壁上的脂質(zhì)沉積。而elisa實(shí)驗也發(fā)現(xiàn),sry微泡顯著的增高了ApoE敲除小鼠單核細(xì)胞CD11-a及血管ICAM-I的蛋白表達(dá)。(P0.05)1.3結(jié)論1.3.1男性血漿微泡中存在SRY DNA,且男性冠心病人血漿微泡及白細(xì)胞中SRY基因表達(dá)及功能均顯著高于正常男性。1.3.2 SRY微泡通過調(diào)節(jié)粘附因子CD11-a及ICAM-1調(diào)節(jié)了單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附作用。1.3.3 SRY微泡通過調(diào)節(jié)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附作用參與了血管動脈粥樣硬化的發(fā)病。研究背景:腎缺血再灌注損傷是臨床上常見的多途徑發(fā)揮作用、多分子參與多因素造成的復(fù)雜病理生理過程。且其發(fā)揮作用的各種因素并非孤立存在,其各種因素相互關(guān)聯(lián)相互影響,也是腎臟的結(jié)構(gòu)與功能由正常到損傷,直至不可逆性造成器官衰竭和功能損傷的關(guān)鍵。腎臟為高灌注器官,大概占心排出容量的20%,當(dāng)腎臟出現(xiàn)血液灌流量不足,通過輸液、補(bǔ)液等恢復(fù)腎臟缺血組織和器官的方式,使腎臟重新恢復(fù)血流得到血氧的供應(yīng)后,不僅能夠直接誘導(dǎo)腎臟實(shí)質(zhì)器官的炎癥反應(yīng)從而影響到局部缺血組織的存活以及功能,并且可以造成全身炎癥性的反應(yīng),累及心臟、肝肺組織、腎臟、小腸、甚至腦等遠(yuǎn)隔器官、從而導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷以及嚴(yán)重的功能障礙[1]。臨床上,在低血容量性創(chuàng)傷性休克或者一些能夠暫時阻斷腎臟血流供應(yīng)的外科手術(shù)中,腎臟血流灌注恢復(fù)后同樣有可能引起腎臟IRI。嚴(yán)重的IRI可導(dǎo)致急性腎功能衰竭(ARF)[2-3],其死亡率大于50%。腎臟IRI更是影響腎臟短期和長期生存的主要非抗原依賴因素,造成的嚴(yán)重程度和繼發(fā)性損傷都可以影響到移植腎臟的存活率及后續(xù)生理功能。怎樣減輕和防止腎臟IRI,一直以來都是腎臟保護(hù)中的重要課題,日益成為臨床和科研關(guān)注的熱點(diǎn)。替羅非班(Tirofiban)是一種新型可逆性非肽類血小板表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑,是非肽酪氨酸衍生物,為整合素家族中的一種小型分子,可抑制纖維蛋白原與血小板糖蛋白Ⅱb/ma受體的結(jié)合,從而抑制血小板聚集以及血栓的形成[4]。具有比較短的抗血小板半衰期以及較長的血漿半衰期。GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑阻斷了血小板聚集的最終通路,可以減少血小板依賴性循環(huán)血流減少的作用時間,并沒有發(fā)現(xiàn)任何并發(fā)癥,被認(rèn)為是最有效地抗血小板藥物之一。Tirofiban具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗細(xì)胞增殖及抗氧化的作用[5-6]。但Tirofiban是否對缺血再灌注損傷腎臟具有保護(hù)作用,目前并沒有此類報道。因此,本次實(shí)驗研究中采取蛋白免疫印跡法(western blot),TUNEL檢測調(diào)亡細(xì)胞和ELISA等實(shí)驗技術(shù),觀察腎缺血再灌注損傷后大鼠血清尿素氮濃度,血清肌酐濃度,腎組織中bax和bcl-2的表達(dá)以及Bax/Bcl-2的比值比,腎缺血再灌注組織中凋亡細(xì)胞的檢測,來探討Tirofiban對大鼠腎缺血再灌注造成損傷的保護(hù)作用和相對的機(jī)制,為臨床防治腎功能損傷和預(yù)防提供可靠地理論依據(jù)。研究目的:研究Tirofiban對大鼠腎臟缺血再灌注損傷(ischemia-reper fusion injury,RIRI)的影響,然后從腎臟組織功能、腎組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、腎組織超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性、缺血再灌注后腎臟組織病理改變等方面探討Tirofiban腎臟保護(hù)作用的作用以及機(jī)制。研究方法:隨機(jī)選取20只雄性SD大鼠,體重平均為250 260g,隨機(jī)性分為四組:假手術(shù)組(control)、假手術(shù)+Tirofiban干預(yù)組(T組)、腎缺血再灌注組(IR組)和腎缺血再灌注+Tirofiban干預(yù)組(IR+T組),每組5只。切除其右側(cè)腎臟組織,無創(chuàng)性動脈夾夾閉大鼠左側(cè)腎動脈45min后,去掉無創(chuàng)動脈夾恢復(fù)腎臟組織血流供應(yīng)的方法建立大鼠腎缺血再灌注24h模型。control組:打開腹腔,分離腎蒂周圍組織,但不夾閉雙側(cè)腎蒂;T組:假手術(shù)組給予Tirofiban(劑量為200μg/kg)IR組夾閉右腎動靜脈45min,給予再灌注,縫合24h后取材進(jìn)行實(shí)驗。IR+T組:腎臟缺血即夾閉左側(cè)腎蒂前15min給予同等劑量Tirofiban。造模成功24h后收集各處理組血清及腎組織標(biāo)本,檢測各組大鼠肌酐SCR、LDH、MDA、SOD、腎組織中bax和bcl-2表達(dá)及Bax/Bcl-2比值比,腎組織中凋亡細(xì)胞的檢測等含量的指標(biāo)變化,行HE染色觀察光鏡下腎組織病理學(xué)結(jié)果,電鏡檢測腎缺血再灌注損傷以后腎臟結(jié)構(gòu)的變化。研究結(jié)果:1.Tirofiban能改善腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腎功能衰竭首先,我們建立SD大鼠腎缺血再灌注損傷模型,觀察Tirofiban對腎缺血再灌注造成腎臟功能損傷的相對應(yīng)保護(hù)及其作用機(jī)制。腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致SD大鼠血AST、尿素氮和血肌酐水平明顯升高,腎功能嚴(yán)重受損,同時腎組織病理切片(HE染色)可見腎小管上皮細(xì)胞損傷明顯,空泡樣變性、壞死,管腔擴(kuò)張,腎小管和腎組織中有較多的血管充血和出血點(diǎn),紅細(xì)胞聚集以及明顯壞死性沉淀,可看到腎小球變性,腎臟間質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重水腫,腫脹壞死變性明顯形成,管腔內(nèi)內(nèi)出現(xiàn)管型嗜酸性粒細(xì)胞。給予Tirofiban預(yù)保護(hù)后,血AST、尿素氮和血肌酐水平顯著下降,并且病理學(xué)評分降低,病理切片提示只有少量細(xì)胞壞死,腎小管損傷程度明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤不明顯,單純性腎間質(zhì)水腫和充血為主。通過血清學(xué)指標(biāo)和組織病理學(xué)評分初步證實(shí)Tirofiban對腎缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。2.Tirofiban能減少腎缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡為進(jìn)一步分析腎組織中細(xì)胞凋亡水平變化,我們采用了TUNEL染色和凋亡蛋白免疫印跡的方法。TUNEL染色提示control組僅見極少數(shù)散在的凋亡細(xì)胞;IR組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著,外髓區(qū)遠(yuǎn)曲小管分布較多,其余少量分布于皮質(zhì)腎小管,也可見部分脫落進(jìn)入到腎小管內(nèi);IR+T組可見少量的TUNEL陽性細(xì)胞。同時,與control組相比,IR后凋亡蛋白caspase-3和Bax蛋白水平增加,Bcl-2水平則降低,給予Tirofiban干預(yù)后相比,caspase-3和Bax蛋白水平顯著下降,Bcl-2水平則升高,再次證實(shí)腎缺血再灌注損傷后Tirofiban可減少細(xì)胞凋亡。3.Tirofiban能減輕腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)為了揭示Tirofiban對腎IRI的保護(hù)機(jī)制,我們檢測了SD大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平,進(jìn)行血清SOD、GSH、MDA、MPO和炎性因子(IL-1β和TNF-β)檢測。與IR組相比,IR+T組可顯著降低缺血再灌注大鼠血清MDA、MPO和炎性因子(IL-1β和TNF-β)水平,同時可顯著提高SOD和GSH水平,降低MDA、MPO和IL-1β、TNF-β水平,提示Tirofiban可能通過氧化應(yīng)激環(huán)節(jié)發(fā)揮其保護(hù)作用。4.Tirofiban通過對NO途徑發(fā)揮對腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用我們分析了一氧化氮合酶和氧化應(yīng)激關(guān)系,既往研究提示腎臟氧化應(yīng)激水平與一氧化氮合酶有密切關(guān)系。為了明確NO是否在Tirofiban對腎缺血再灌注損傷保護(hù)作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用,檢測了內(nèi)皮型一氧化氮合酶(e NOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(i NOS)水平,在IR組和IR+T組,兩者的變化趨勢相反。為了明確e NOS和i NOS的作用,采用腎臟內(nèi)皮細(xì)胞(NRK52E細(xì)胞株)建立缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型,分別加入e NOS和i NOS的抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)和甲基異硫脲(SMT),L-NAME可明顯阻斷Tirofiban對腎臟內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。這一結(jié)果證實(shí)在腎臟缺血再灌注損傷過程中,Tirifiban通過對e NOS的調(diào)控發(fā)揮其對腎臟的保護(hù)作用。結(jié)論:1.Tirofiban能夠改善腎臟缺血再灌注所致的腎臟損傷,有助于腎臟功能恢復(fù)。2.Tirofiban對缺血再灌注后的腎組織具有顯著的抗損傷、抗凋亡和抗氧化作用。3.Tirofiban對腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是通過NO信號通路來完成。4.在各實(shí)驗組檢測到的不同數(shù)據(jù),為腎臟缺血再灌注損傷及Tirofiban預(yù)處理后特異性的表達(dá),進(jìn)一步研究數(shù)據(jù)差異,深入了解Tirofiban保護(hù)腎臟缺血再灌注損傷的功能及其內(nèi)在機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：微泡 SRY 基因拷貝數(shù) ICAM-1 CD11-a 動脈粥樣硬化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5;R692
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 第一部分6-43
• ABSTRACT6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 細(xì)胞外微泡中SRY基因在動脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制14-40
• 2.1 材料與方法14-31
• 2.2 結(jié)果31-37
• 2.3 討論37-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 第二部分43-84
• Abstract43-47
• 中文摘要47-50
• 前言50-51
• 材料與方法51-68
• 實(shí)驗結(jié)果68-76
• 討論76-80
• 結(jié)論80-81
• 參考文獻(xiàn)81-84
• 文獻(xiàn)綜述 細(xì)胞外囊泡在動脈粥樣硬化發(fā)病中的機(jī)制研究進(jìn)展84-97
• 參考文獻(xiàn)91-97
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表文章情況97-98
• 致謝98-99

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本文編號：420086