發(fā)布時間：2017-06-04 05:12

  本文關鍵詞：SRY在動脈粥樣硬化和Tirofiban在腎缺血再灌注中的作用機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細胞外微泡(extracellular vesicles,EVs)是一類體積較小的膜囊泡。,是從細胞膜表面脫落產生的囊泡,具有雙層脂質分子結構,其結構包括細胞膜,胞漿和部分蛋白質和遺傳物質。EVs包括外泌體(exosomes)和脫落囊泡兩類,前者為細胞胞吐作用產生的多胞體,后者由細胞出芽生殖產生。既往的研究認為EVs是不具有功能的細胞塵埃,但是大量近期研究表明,它是一種重要的細胞交流載體,具有重要的生物學功能。本實驗室的前期研究表明,微泡中存在的DNA可以通過胞吞作用或膜融合從一個細胞進入另一個細胞。利用微泡轉運的DNA進入新的細胞之后可以融合進入接受細胞的基因組,編碼相應的mRNA和蛋白質。但是,微泡DNA在疾病中發(fā)揮的病理作用尚不完全清楚�，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)微泡在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用,參與了腫瘤細胞的浸潤和遠處播散。腫瘤細胞來源的微泡可以使正常細胞表現(xiàn)出癌變的表型。除腫瘤以外,微泡也參與多種疾病的發(fā)病過程。越來越多的證據顯示,通過細胞間通訊,微泡調節(jié)血小板的黏附性以及白細胞和內皮的相互連接,參與了動脈粥樣硬化的病理過程。但是否微泡中DNA參與了這一過程,尚不清楚。另一方面,Y染色體,除了是保證男性特征的重要因素以外,在心血管疾病中發(fā)病的作用也越來越引起研究者的重視。一些研究發(fā)現(xiàn)Y染色體上的一重要基因SRY(sex determining region,Y;即Y染色體性別決定域)對增加血管緊張素Ⅱ和去甲腎上腺素水平具有調節(jié)作用。而男性多體性的Y染色體(大部分為XYY核型)可顯著的增加冠心病的發(fā)病風險。而微泡中是否含有SRY基因DNA,該DNA是否參與了動脈粥樣硬化的病理過程,尚不清楚。因此,本研究擬以人群研究、實驗動物分析及細胞實驗為研究方法,分析血中游離微泡所含SRY DNA對白細胞和內皮細胞相互作用的影響及其在動脈粥樣硬化病理過程中的作用機制。1.1研究方法1.1.1分析男性冠心病患者srydna基因拷貝數(shù)(genecopynumber,gcn)的變化情況本部分實驗以正常男性及男性冠心病患者的血液樣本為研究對象,利用pcr、dna測序技術、實時定量pcr和免疫印跡法等技術手段,分析srydna基因拷貝數(shù)的在不同人群的改變情況。1.1.2研究微泡中srydna的轉移性及功能本部分實驗構建sry-hek293細胞株,分析sry-hek293來源的微泡對單核細胞黏附蛋白cd11-a及內皮細胞黏附蛋白icam-1表達的作用,sry蛋白對cd11-a及icam-1基因啟動子的調控作用,sry微泡對單核細胞/內皮細胞粘附的作用。1.1.3研究微泡中srydna對apoe敲除小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生的作用。本部分實驗將利用apoe敲除小鼠,分析sry微泡對小鼠動脈粥樣硬化的影響,以及對小鼠單核細胞和內皮細胞粘附蛋白cd11-a及icam-1表達的影響。1.2研究結果1.2.1在該部分實驗中,我們首先證實了男性血漿微泡中存在srydna,且男性冠心病人血漿微泡中sry基因拷貝數(shù)顯著的高于正常男性。而男性冠心病患者白細胞sry的基因拷貝數(shù)、mrna表達及蛋白表達同樣均顯著的高于來源于正常男性的白細胞(p0.05)。進一步的研究發(fā)現(xiàn),男性冠心病患者白細胞上黏附因子cd11-a的蛋白表達顯著的高于對照人群(p0.05)。1.2.2為分析微泡中srydna的功能,本實驗首先構建了表達sry基因的hek293細胞并對該細胞系微泡中的srydna進行鑒定。結果顯示,sry-hek293細胞分泌微泡中存在srydna及蛋白的表達。sry微泡可顯著的增高單核細胞粘附因子cd11-a及內皮細胞粘附因子icam-1的蛋白表達(p0.05)。sry蛋白與cd11-a及icam-1啟動子均有結合,提示sry對cd11-a及icam-1的調節(jié)作用存在于轉錄水平,并進一步增加了thp-1細胞與huvecs細胞的粘附作用(p0.05)。1.2.3進一步的實驗在動物水平驗證之前的結構。利用血管組織的油紅o染色及組織h/e染色,對斑塊形成情況進行觀察,結果發(fā)現(xiàn):使用sry微泡注射可顯著增大動脈粥樣斑塊的面積,加重血管壁上的脂質沉積。而elisa實驗也發(fā)現(xiàn),sry微泡顯著的增高了ApoE敲除小鼠單核細胞CD11-a及血管ICAM-I的蛋白表達。(P0.05)1.3結論1.3.1男性血漿微泡中存在SRY DNA,且男性冠心病人血漿微泡及白細胞中SRY基因表達及功能均顯著高于正常男性。1.3.2 SRY微泡通過調節(jié)粘附因子CD11-a及ICAM-1調節(jié)了單核細胞與內皮細胞間的粘附作用。1.3.3 SRY微泡通過調節(jié)單核細胞與內皮細胞間的粘附作用參與了血管動脈粥樣硬化的發(fā)病。研究背景:腎缺血再灌注損傷是臨床上常見的多途徑發(fā)揮作用、多分子參與多因素造成的復雜病理生理過程。且其發(fā)揮作用的各種因素并非孤立存在,其各種因素相互關聯(lián)相互影響,也是腎臟的結構與功能由正常到損傷,直至不可逆性造成器官衰竭和功能損傷的關鍵。腎臟為高灌注器官,大概占心排出容量的20%,當腎臟出現(xiàn)血液灌流量不足,通過輸液、補液等恢復腎臟缺血組織和器官的方式,使腎臟重新恢復血流得到血氧的供應后,不僅能夠直接誘導腎臟實質器官的炎癥反應從而影響到局部缺血組織的存活以及功能,并且可以造成全身炎癥性的反應,累及心臟、肝肺組織、腎臟、小腸、甚至腦等遠隔器官、從而導致進一步的組織損傷以及嚴重的功能障礙[1]。臨床上,在低血容量性創(chuàng)傷性休克或者一些能夠暫時阻斷腎臟血流供應的外科手術中,腎臟血流灌注恢復后同樣有可能引起腎臟IRI。嚴重的IRI可導致急性腎功能衰竭(ARF)[2-3],其死亡率大于50%。腎臟IRI更是影響腎臟短期和長期生存的主要非抗原依賴因素,造成的嚴重程度和繼發(fā)性損傷都可以影響到移植腎臟的存活率及后續(xù)生理功能。怎樣減輕和防止腎臟IRI,一直以來都是腎臟保護中的重要課題,日益成為臨床和科研關注的熱點。替羅非班(Tirofiban)是一種新型可逆性非肽類血小板表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑,是非肽酪氨酸衍生物,為整合素家族中的一種小型分子,可抑制纖維蛋白原與血小板糖蛋白Ⅱb/ma受體的結合,從而抑制血小板聚集以及血栓的形成[4]。具有比較短的抗血小板半衰期以及較長的血漿半衰期。GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑阻斷了血小板聚集的最終通路,可以減少血小板依賴性循環(huán)血流減少的作用時間,并沒有發(fā)現(xiàn)任何并發(fā)癥,被認為是最有效地抗血小板藥物之一。Tirofiban具有抗炎、抗細胞凋亡、抗細胞增殖及抗氧化的作用[5-6]。但Tirofiban是否對缺血再灌注損傷腎臟具有保護作用,目前并沒有此類報道。因此,本次實驗研究中采取蛋白免疫印跡法(western blot),TUNEL檢測調亡細胞和ELISA等實驗技術,觀察腎缺血再灌注損傷后大鼠血清尿素氮濃度,血清肌酐濃度,腎組織中bax和bcl-2的表達以及Bax/Bcl-2的比值比,腎缺血再灌注組織中凋亡細胞的檢測,來探討Tirofiban對大鼠腎缺血再灌注造成損傷的保護作用和相對的機制,為臨床防治腎功能損傷和預防提供可靠地理論依據。研究目的:研究Tirofiban對大鼠腎臟缺血再灌注損傷(ischemia-reper fusion injury,RIRI)的影響,然后從腎臟組織功能、腎組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、腎組織超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性、缺血再灌注后腎臟組織病理改變等方面探討Tirofiban腎臟保護作用的作用以及機制。研究方法:隨機選取20只雄性SD大鼠,體重平均為250 260g,隨機性分為四組:假手術組(control)、假手術+Tirofiban干預組(T組)、腎缺血再灌注組(IR組)和腎缺血再灌注+Tirofiban干預組(IR+T組),每組5只。切除其右側腎臟組織,無創(chuàng)性動脈夾夾閉大鼠左側腎動脈45min后,去掉無創(chuàng)動脈夾恢復腎臟組織血流供應的方法建立大鼠腎缺血再灌注24h模型。control組:打開腹腔,分離腎蒂周圍組織,但不夾閉雙側腎蒂;T組:假手術組給予Tirofiban(劑量為200μg/kg)IR組夾閉右腎動靜脈45min,給予再灌注,縫合24h后取材進行實驗。IR+T組:腎臟缺血即夾閉左側腎蒂前15min給予同等劑量Tirofiban。造模成功24h后收集各處理組血清及腎組織標本,檢測各組大鼠肌酐SCR、LDH、MDA、SOD、腎組織中bax和bcl-2表達及Bax/Bcl-2比值比,腎組織中凋亡細胞的檢測等含量的指標變化,行HE染色觀察光鏡下腎組織病理學結果,電鏡檢測腎缺血再灌注損傷以后腎臟結構的變化。研究結果:1.Tirofiban能改善腎缺血再灌注損傷導致的腎功能衰竭首先,我們建立SD大鼠腎缺血再灌注損傷模型,觀察Tirofiban對腎缺血再灌注造成腎臟功能損傷的相對應保護及其作用機制。腎缺血再灌注損傷導致SD大鼠血AST、尿素氮和血肌酐水平明顯升高,腎功能嚴重受損,同時腎組織病理切片(HE染色)可見腎小管上皮細胞損傷明顯,空泡樣變性、壞死,管腔擴張,腎小管和腎組織中有較多的血管充血和出血點,紅細胞聚集以及明顯壞死性沉淀,可看到腎小球變性,腎臟間質出現(xiàn)嚴重水腫,腫脹壞死變性明顯形成,管腔內內出現(xiàn)管型嗜酸性粒細胞。給予Tirofiban預保護后,血AST、尿素氮和血肌酐水平顯著下降,并且病理學評分降低,病理切片提示只有少量細胞壞死,腎小管損傷程度明顯減輕,炎性細胞浸潤不明顯,單純性腎間質水腫和充血為主。通過血清學指標和組織病理學評分初步證實Tirofiban對腎缺血再灌注損傷具有保護作用。2.Tirofiban能減少腎缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡為進一步分析腎組織中細胞凋亡水平變化,我們采用了TUNEL染色和凋亡蛋白免疫印跡的方法。TUNEL染色提示control組僅見極少數(shù)散在的凋亡細胞;IR組TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著,外髓區(qū)遠曲小管分布較多,其余少量分布于皮質腎小管,也可見部分脫落進入到腎小管內;IR+T組可見少量的TUNEL陽性細胞。同時,與control組相比,IR后凋亡蛋白caspase-3和Bax蛋白水平增加,Bcl-2水平則降低,給予Tirofiban干預后相比,caspase-3和Bax蛋白水平顯著下降,Bcl-2水平則升高,再次證實腎缺血再灌注損傷后Tirofiban可減少細胞凋亡。3.Tirofiban能減輕腎缺血再灌注損傷導致的氧化應激反應為了揭示Tirofiban對腎IRI的保護機制,我們檢測了SD大鼠體內氧化應激水平,進行血清SOD、GSH、MDA、MPO和炎性因子(IL-1β和TNF-β)檢測。與IR組相比,IR+T組可顯著降低缺血再灌注大鼠血清MDA、MPO和炎性因子(IL-1β和TNF-β)水平,同時可顯著提高SOD和GSH水平,降低MDA、MPO和IL-1β、TNF-β水平,提示Tirofiban可能通過氧化應激環(huán)節(jié)發(fā)揮其保護作用。4.Tirofiban通過對NO途徑發(fā)揮對腎缺血再灌注損傷的保護作用我們分析了一氧化氮合酶和氧化應激關系,既往研究提示腎臟氧化應激水平與一氧化氮合酶有密切關系。為了明確NO是否在Tirofiban對腎缺血再灌注損傷保護作用中發(fā)揮關鍵作用,檢測了內皮型一氧化氮合酶(e NOS)和誘導型一氧化氮合酶(i NOS)水平,在IR組和IR+T組,兩者的變化趨勢相反。為了明確e NOS和i NOS的作用,采用腎臟內皮細胞(NRK52E細胞株)建立缺氧復氧細胞模型,分別加入e NOS和i NOS的抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)和甲基異硫脲(SMT),L-NAME可明顯阻斷Tirofiban對腎臟內皮細胞的保護作用。這一結果證實在腎臟缺血再灌注損傷過程中,Tirifiban通過對e NOS的調控發(fā)揮其對腎臟的保護作用。結論:1.Tirofiban能夠改善腎臟缺血再灌注所致的腎臟損傷,有助于腎臟功能恢復。2.Tirofiban對缺血再灌注后的腎組織具有顯著的抗損傷、抗凋亡和抗氧化作用。3.Tirofiban對腎缺血再灌注損傷的保護作用是通過NO信號通路來完成。4.在各實驗組檢測到的不同數(shù)據,為腎臟缺血再灌注損傷及Tirofiban預處理后特異性的表達,進一步研究數(shù)據差異,深入了解Tirofiban保護腎臟缺血再灌注損傷的功能及其內在機制。
【關鍵詞】：微泡 SRY 基因拷貝數(shù) ICAM-1 CD11-a 動脈粥樣硬化
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5;R692
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 第一部分6-43
• ABSTRACT6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 細胞外微泡中SRY基因在動脈粥樣硬化中的作用及機制14-40
• 2.1 材料與方法14-31
• 2.2 結果31-37
• 2.3 討論37-40
• 參考文獻40-43
• 第二部分43-84
• Abstract43-47
• 中文摘要47-50
• 前言50-51
• 材料與方法51-68
• 實驗結果68-76
• 討論76-80
• 結論80-81
• 參考文獻81-84
• 文獻綜述 細胞外囊泡在動脈粥樣硬化發(fā)病中的機制研究進展84-97
• 參考文獻91-97
• 攻讀博士學位期間發(fā)表文章情況97-98
• 致謝98-99

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  本文關鍵詞：SRY在動脈粥樣硬化和Tirofiban在腎缺血再灌注中的作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：420086