本文關鍵詞：黃綠青霉素致血管內皮毒性機理和對動脈粥樣硬化發(fā)病的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景心血管疾病是起病隱匿、病程較長,預后較差且發(fā)病率、死亡率高的慢性非傳染性疾病,嚴重威脅人類的健康和生活質量。針對導致心血管疾病的可控原因開展一級預防是減少發(fā)病的主要措施。然而由于病因多樣、發(fā)病機制復雜,在心血管病的防治研究中要不斷深化和拓展心血管病的病因和發(fā)病機理的探索,從復雜的環(huán)境中尋找各個方面的致病因子,并依此提出預防措施。真菌毒素(mycotoxin)是由真菌產生、主要存在于糧食及其制品、動物飼料中的一大類代謝物。在糧食短缺時期由于攝入霉變糧食,曾造成嚴重的真菌毒素中毒事件。據聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織(FAO)估計,全球約有1/4-1/3的谷物受到真菌毒素的污染,飼料污染的情況則可能更為嚴重,是最危險的谷物天然污染物。近年來諸多研究證明真菌毒素與心血管疾病的發(fā)病有關,其中黃綠青霉素(citreoviridin, CIT)是真菌毒素中與心血管損傷關系最為密切的一種。以往研究發(fā)現CIT可抑制血管內皮的增殖,影響內皮細胞正常調節(jié)功能,影響粘附分子的表達和釋放。由于血管內皮的損傷和由此引起的血管炎癥性病變是動脈粥樣硬化的始動因素,而動脈粥樣硬化又是心血管疾病的病理基礎,因此我們提出以下假設：CIT毒素可干擾內皮細胞的正常功能,引發(fā)血管內皮損傷,進而促進動脈粥樣硬化的發(fā)病�；诖搜芯考僭O,本研究從體外細胞培養(yǎng)和體內的動物實驗兩個方面觀察了CIT對血管內皮細胞粘附功能的影響,分析了CIT在動脈粥樣硬化發(fā)病中的作用。藥物與蛋白質等生物大分子的相互結合和結構變化,決定了藥理或毒理作用的發(fā)生和發(fā)展,也影響到藥物在人體內吸收和代謝。通過各種方法探討藥物與蛋白質等生物大分子的相互作用,有助于闡明藥物生物學作用的機理。血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)、免疫球蛋白(Immunoglobulin, IgG)和溶菌酶(Lysozyme, LOM)在生物體內發(fā)揮了重要的功能,常被選為開展該類研究的蛋白質模型。因此,本研究采用熒光光譜(fluorescence spectroscopy, FS)、紫外光譜(ultraviolet spectroscopy, UVS)、紅外光譜(infrared spectroscopy,IR)、圓二色譜(circular dichroism, CD)分析了CIT與HSA、IgG和LOM相互作用的機理,并采用分子模擬技術構建了CIT與三種蛋白質相互作用的分子模型。生態(tài)學研究(ecological study)是在群體水平探討暴露因素與疾病之間聯(lián)系的流行病學方法,通過比較不同地區(qū)、不同時間或不同人群之間在群體水平上暴露劑量的差異與疾病發(fā)病、患病或死亡水平的高低,分析暴露因素是否為疾病的潛在病因。該類研究具有過程簡單、數據分析簡便的優(yōu)點,并能夠快速得出研究結論。盡管生態(tài)學研究還有諸多方法學上的缺陷,比如無法評價個體水平上暴露因素與疾病之間的聯(lián)系、容易產生生態(tài)學謬誤等,但該方法在從宏觀的角度去提出病因假設或提供證據方面還是具有獨特的優(yōu)勢,尤其是對于暴露因素的暴露劑量無法準確定量的疾病,該方法提供了比較直接的研究途徑。故本論文通過一項生態(tài)學研究,比較了冠心病發(fā)病水平不同的兩個地區(qū)CIT毒素在糧食中的污染程度,分析冠心病與糧食中CIT污染之間的潛在聯(lián)系。目的1.通過體外培養(yǎng)血管內皮細胞,觀察CIT對腫瘤壞死因子a(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)誘導的血管內皮細胞粘附功能的影響；2.通過動物實驗觀察CIT在動脈粥樣硬化發(fā)病中對粥樣斑塊的形成和血管炎癥反應的影響；3.采用光譜分析方法和分子對接模擬技術,分析CIT與三種生物大分子：人血清白蛋白、人免疫球蛋白和溶菌酶發(fā)生化學結合和相互作用的機理；4.通過生態(tài)學研究,比較在冠心病發(fā)病率不同的地區(qū)CIT污染的程度,分析冠心病與糧食中CIT污染之間的潛在聯(lián)系。方法通過體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),分別用CIT、TNF-a和CIT+TNF-a三種染毒方式處理HUVECs.經藥物作用6h后觀察HUVECs與單核細胞的粘附作用強度；用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定內皮細胞釋放的細胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、E選擇素(E-selectin);用蛋白免疫印跡法(Western blotting)法檢測ICAM-1、VCAM-1和E-selectin三種蛋白在細胞內的表達水平；采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法測定單核細胞趨化因子-1(Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)在細胞內的轉錄水平；針對核轉錄因子κB (Nuclear Factor-kappa B, NF-κB)的活性亞基p65進行免疫熒光染色法,檢測其由細胞質向細胞核內轉移和激活情況；用蛋Western blotting法檢測NF-κB p65亞基在細胞核內的含量。以“西方類型膳食”型高脂飼料(含有膽固醇0.150%,脂肪21%)飼養(yǎng)載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠,采用高劑量CIT (1.0mg/kg)和低劑量CIT (0.5mg/kg)染毒15周后測定相關實驗指標。用生化分析儀測定TG、TC、HDL、LDL、VLDL等血脂指標；取小鼠整條主動脈標本和心臟標本,免疫組化法檢測主動脈根部內皮VCAM-1、ICAM-1、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)、內皮素-1(Endothelin-1, ET-1)的表達情況；ELISA法檢測血清ET-1、VEGF含量；實時定量PCR(Real Time PCR)測定主動脈ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA的轉錄水平；油紅O染色法診斷主動脈中脂質斑塊的形成情況。在實驗室內模擬CIT與HSA、IgG、LOM進行化學結合和相互作用的過程,采用熒光光譜、紅外光譜、圓二色性光譜、紫外光譜等方法分析CIT與生物大分子相互作用位點、測定作用力類型、分析結構變化和結合過程中的能量轉移情況,用分子對接模擬技術繪制相互作用的分子模型。采用生態(tài)學研究的方法,在收集黑龍江省依安縣和樺川縣2008-2011年冠心病死亡數據,并采集大米、面粉、小米等糧食樣品,測定糧食中CIT污染情況,分析比較CIT污染程度與冠心病發(fā)病水平之間的關聯(lián)。結果1.CIT處理組HUVECs與單核細胞發(fā)生粘附作用的強度高于對照組,細胞上清液ICAM-1、VCAM-1和E選擇素等粘附分子濃度高于對照組；CIT處理組細胞內ICAM-1、VCAM-1和E選擇素等蛋白的表達量高于對照組；CIT處理組細胞NF-κB在細胞核內的表達量高于對照組。2.CIT處理組小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積高于對照組,動脈內膜和斑塊中ET-1、VEGF、VCAM-1、ICAM-1表達量高于對照組,小鼠血清VEGF、ET-1含量高于對照組。3.通過分析CIT與HSA、IgG和LOM的相互作用,計算結合常數和結合位點數,發(fā)現CIT與HSA結合的熒光猝滅機制為動態(tài)猝滅,與IgG結合的熒光猝滅機制為動態(tài)猝滅,與LOM的結合可增強熒光效應；CIT與HSA、IgG和LOM的結合位置距色氨酸殘基的距離分別為3.25、3.32和3.61 nm,小于7 nm,結合過程發(fā)生了能量轉移；由熱力學參數的結果結合分子模擬研究,確定CIT與HSA間的作用力主要是疏水力和氫鍵,與IgG和LOM的作用力主要是疏水力和靜電作用,并兼有氫鍵。4.2008-2011年依安縣各年齡組冠心病死亡率均高于樺川縣,依安縣糧食中CIT毒素含量高于樺川縣。結論1.CIT促進了TNF-α誘導的血管內皮細胞的粘附作用,該作用是通過增強內皮細胞NF-κB的核內易位,誘導相關基因轉錄,使得ICAM-1,VCAM-1,E選擇素等粘附分子的表達增高。2.CIT增強了高脂飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動脈的炎癥反應,加重了動脈粥樣硬化的病變程度。3.CIT與HSA、IgG和LOM的結合過程發(fā)生了能量轉移和二級結構的變化,本文分析確定了CIT與三種蛋白之間的作用力類型,獲得了相互作用的參數指標。4.依安縣和樺川縣兩地冠心病死亡率的差異可能與糧食的CIT污染程度有關聯(lián)。
【關鍵詞】：黃綠青霉素 血管內皮細胞 動脈粥樣硬化
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-16
• 符號說明16-17
• 第一部分：黃綠青霉素對內皮細胞粘附功能的影響和對動脈粥樣硬化的影響17-32
• 一、前言17-18
• 二、材料與方法18-23
• 三、結果23-25
• 四、討論25-28
• 五、參考文獻28-32
• 第二部分：黃綠青霉素與血清白蛋白、免疫球蛋白和溶菌酶的結合作用機理32-45
• 一、前言32
• 二、材料與方法32-34
• 三、結果34-40
• 四、討論40-42
• 五、參考文獻42-45
• 第三部分：黑龍江依安縣和樺川縣糧食黃綠青霉素污染與冠心病關系的生態(tài)學研究45-51
• 一、前言45
• 二、材料與方法45-47
• 三、結果47-48
• 四、討論48-49
• 五、參考文獻49-51
• 結論51-52
• 創(chuàng)新點52
• 局限性52-53
• 附圖53-73
• 文獻綜述73-80
• 參考文獻76-80
• 致謝80-81
• 攻讀學位期間取得的學術成果81-83
• 附英文論文三篇83-123
• 論文183-94
• 論文294-106
• 論文3106-123
• 學位論文評閱及答辯情況表123

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前4條

1 惠洋;曹艷紅;王紹萍;董薇;孫樹秋;;低劑量黃綠青霉素對大鼠心肌細胞色素C氧化酶與琥珀酸脫氫酶活性的影響[J];中國地方病學雜志;2007年06期

2 劉密鳳;王麗華;林林;姚洪菊;張芳鳴;王文革;楊建伯;;黃綠青霉素對心臟毒性損傷作用[J];中國公共衛(wèi)生;2007年05期

3 侯海峰;李成;李群偉;李東娟;葉文靜;焦鵬;;黃綠青霉素對人血管內皮細胞凋亡和DNA損傷的作用[J];中國預防醫(yī)學雜志;2011年04期

4 劉密鳳;姜昕;姚紅菊;;黃綠青霉素致心肌細胞DNA損傷觀察[J];中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志;2006年03期

  本文關鍵詞：黃綠青霉素致血管內皮毒性機理和對動脈粥樣硬化發(fā)病的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：398495