調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg cells)在維持機體的免疫耐受與免疫平衡等方面發(fā)揮著尤為重要的作用。叉頭框P3蛋白(forkhead box P3,FOXP3)是Treg細胞關鍵的轉錄因子并且對Treg細胞的免疫抑制功能非常重要。轉錄因子FOXP3受多方面的調控,例如轉錄調控,蛋白復合體的調控,以及翻譯后修飾水平上的調控,共同完善了Treg細胞的發(fā)育與功能機制。其中,FOXP3蛋白的翻譯后修飾包括乙�；⒘姿峄c泛素化,影響著FOXP3與Treg細胞的穩(wěn)定性與功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)多個泛素連接酶或去泛素化酶調控FOXP3蛋白K48位多聚泛素化修飾,從而影響FOXP3蛋白與Treg細胞的功能,但我們對于FOXP3蛋白發(fā)生的其它類型的泛素化修飾卻知之甚少。由于發(fā)生的位點與類型的不同,泛素化修飾不僅造成蛋白降解,也可能穩(wěn)定蛋白的功能,因此,還有其它調控FOXP3蛋白泛素化修飾的酶有待發(fā)現(xiàn)。泛素連接酶MDM2(murine double minute 2)介導抑癌蛋白p53的泛素化修飾并使其降解,最近研究發(fā)現(xiàn)它也能負調控T細胞的激活,但它是否調控Treg細胞的功能...

【文章頁數(shù)】：163 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 調節(jié)性T細胞的簡介
    1.2 Treg細胞的發(fā)育
    1.3 Treg細胞發(fā)揮免疫抑制功能的機制
        1.3.1 抑制性細胞因子
        1.3.2 細胞裂解作用
        1.3.3 代謝紊亂
        1.3.4 靶向樹突狀細胞的抑制作用
    1.4 Treg細胞轉錄因子FOXP3 的調控機制
        1.4.1 FOXP3 的轉錄調控
        1.4.2 FOXP3 蛋白復合體
        1.4.3 FOXP3 的翻譯后修飾調控
    1.5 MDM2 蛋白與功能
    1.6 AMPK蛋白與功能
第2章 材料與方法
    2.1 抗體與試劑
        2.1.1 抗體
        2.1.2 試劑
    2.2 質粒與引物
    2.3 實驗動物
    2.4 細胞培養(yǎng)
        2.4.1 培養(yǎng)基的配制
        2.4.2 細胞系的培養(yǎng)
        2.4.3 人原代Treg細胞的培養(yǎng)
    2.5 在人血中分離PBMC
    2.6 從小鼠脾臟、淋巴結和胸腺中分離淋巴細胞
    2.7 富集CD4⁺T 細胞
        2.7.1 人源CD4⁺T 細胞
        2.7.2 小鼠來源的CD4⁺T 細胞
    2.8 原代細胞的分選
    2.9 流式染色
    2.10 人源Treg細胞的免疫抑制實驗
    2.11 慢病毒的包裝、純化與富集
        2.11.1 慢病毒的包裝
        2.11.2 慢病毒的純化與富集
    2.12 慢病毒感染細胞
        2.12.1 慢病毒感染人原代Treg細胞
        2.12.2 慢病毒感染人原代Teff細胞
        2.12.3 慢病毒感染Jurkat細胞系
    2.13 RNA的抽提,反轉錄與實時定量PCR
        2.13.1 RNA的抽提
        2.13.2 反轉錄
        2.13.3 實時定量PCR
    2.14 HEK293T細胞的轉染
    2.15 免疫共沉淀
        2.15.1 外源免疫共沉淀
        2.15.2 內源免疫共沉淀
    2.16 懸浮細胞的免疫熒光實驗
        2.16.1 試劑的準備
        2.16.2 實驗過程
    2.17 His-pull-down實驗
        2.17.1 緩沖液的配制
        2.17.2 實驗過程
    2.18 體外泛素化修飾實驗
    2.19 免疫印跡實驗
    2.20 小鼠饑餓與甲型流感病毒感染模型
    2.21 小鼠肺中淋巴細胞的分離
    2.22 統(tǒng)計學分析
第3章 實驗結果
    3.1 泛素連接酶MDM2 通過泛素化轉錄因子FOXP3 正調控Treg細胞的功能
        3.1.1 泛素連接酶MDM2 正調控人原代Treg細胞的功能
        3.1.2 泛素連接酶MDM2 調控關鍵轉錄因子FOXP3 的蛋白水平
        3.1.3 MDM2 穩(wěn)定FOXP3 蛋白的表達依賴于其泛素連接酶活性
        3.1.4 泛素連接酶MDM2 能夠與轉錄因子FOXP3 發(fā)生相互作用
        3.1.5 泛素連接酶MDM2 能對FOXP3 蛋白進行泛素化修飾
        3.1.6 泛素連接酶MDM2 介導FOXP3 蛋白的多個位點發(fā)生泛素化修飾
        3.1.7 TCR/CD28 信號促進Treg細胞中MDM2 表達水平的升高
        3.1.8 過表達MDM2 蛋白增強人原代Treg細胞的功能
    3.2 對蛋白激酶AMPK在 Treg細胞中發(fā)揮功能的探索
        3.2.1 蛋白激酶AMPK能夠與轉錄因子FOXP3 相互作用
        3.2.2 AMPK在 Foxp3^CrePRKAA1^fl/flPRKAA2^fl/fl小鼠的Treg細胞中被特異性敲除
        3.2.3 Foxp3^CrePRKAA1^fl/flPRKAA2^fl/fl小鼠沒有表現(xiàn)出T細胞的過度活化
        3.2.4 Treg細胞中AMPK的缺失不影響Teff細胞產生細胞因子與Treg細胞的比例
        3.2.5 Foxp3^CrePRKAA1^fl/flPRKAA2^fl/fl小鼠能夠抵抗饑餓處理導致的T細胞來源細胞因子的減少
        3.2.6 甲型流感病毒感染后,Foxp3^CrePRKAA1^fl/flPRKAA2^fl/fl小鼠沒有明顯的表型
        3.2.7 與Foxp3^YFP-Cre小鼠相比,饑餓刺激的Foxp3^CrePRKAA1^fl/flPRKAA2^fl/fl小鼠更容易被甲型流感病毒感染
第4章 總結與討論
參考文獻
致謝
作者簡歷及攻讀學位期間發(fā)表的學術論文與研究成果
專業(yè)綜述
    References



本文編號：3984651