背景與目的:宮頸癌是全球婦女癌癥中僅次于乳腺癌居第四位的癌癥,2018年全球?qū)m頸癌發(fā)病人數(shù)57萬例,死亡人數(shù)31.1萬。宮頸的高危型人乳頭瘤病毒(High risk human papillomavirus,HR-HPV)的持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宮頸癌的直接病因,其中HPV16型的發(fā)病率最高,占53%。HPV16 E7蛋白是HPV致癌的關(guān)鍵分子,HPV16 E7蛋白只選擇性表達在腫瘤細胞中,隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變從CIN1到CIN3進展,HPV16 E7蛋白的表達向外層推進越明顯且表達量越來越高,最終HPV16 E7蛋白出現(xiàn)在宮頸脫落細胞中。細胞學(xué)檢查(如TCT)聯(lián)合HR-HPV DNA檢測,可以增加宮頸上皮內(nèi)瘤變CIN3、宮頸原位腺癌和浸潤性宮頸腺癌的檢出率。目前,人乳頭瘤病毒(HPV)的臨床檢測方法主要是基于PCR的方法,但是PCR法只能用于檢測HPV DNA和HPV分型,但不能檢測HPV E6、E7致癌蛋白,所以預(yù)測HPV陽性癌癥如宮頸癌的準確率不高。本研究的目的是針對那些細胞學(xué)檢測為陰性而HR...

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【學(xué)位級別】：博士

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摘要
ABSTRACT
第1章 文獻綜述 基于人乳頭瘤病毒的免疫診斷和免疫療法用于HPV誘發(fā)癌癥的研究進展
    1.1 引言
    1.2 基于HPV的免疫診斷
        1.2.1 檢測腫瘤組織和細胞中的HPV蛋白抗原
        1.2.2 檢測患者唾液或陰道沖洗液中的抗HPV蛋白抗體
        1.2.3 檢測患者血清中抗HPV抗體
    1.3 基于HPV的免疫治療
        1.3.1 用于治療的天然抗HPV蛋白單克隆抗體
        1.3.2 用于治療的基于HPV蛋白mAb的放射免疫療法
        1.3.3 用于治療的親和毒素
        1.3.4 用于治療的HPV細胞內(nèi)單鏈抗體(scFvs)
        1.3.5 用于治療的HPV納米抗體
        1.3.6 治療性疫苗接種
    1.4 結(jié)論和展望
第2章 引言
    2.1 研究背景及目的意義
    2.2 主要研究內(nèi)容
        2.2.1 HPV16E7蛋白的制備
        2.2.2 HPV16E7蛋白單克隆抗體的制備
        2.2.3 HPV16E7蛋白單克隆抗體的表征
        2.2.4 HPV16 E7 蛋白單克隆抗體在免疫化學(xué)、免疫熒光和Western Blot中的診斷應(yīng)用
        2.2.5 HPV16 E7 蛋白單克隆抗體在常規(guī)雙抗夾心ELISA中定量檢測HPV16 E7 蛋白的診斷應(yīng)用
        2.2.6 HPV16 E7 蛋白單克隆抗體在化學(xué)發(fā)光免疫分析方法中定量檢測HPV16 E7 蛋白的診斷應(yīng)用
    2.3 技術(shù)總路線
第3章 HPV16 E7 基因的克隆、表達及HPV16 E7 蛋白的純化
    3.1 材料和方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 重組質(zhì)粒p ET-28a(+)-HPV16 E7 的構(gòu)建
        3.2.2 HPV16E7蛋白的誘導(dǎo)表達
        3.2.3 HPV16E7蛋白的表達形式和鎳柱純化
        3.2.4 HPV16 E7 蛋白的DEAE柱純化及其二級結(jié)構(gòu)的測定
    3.3 討論
        3.3.1 HPV16E7基因的克隆、鑒定
        3.3.2 HPV16E7蛋白的表達和純化
    3.4 小結(jié)
第4章 HPV16E7蛋白單克隆抗體的制備和純化
    4.1 材料和方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 HPV16E7蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株的建立
        4.2.2 HPV16E7蛋白單克隆抗體腹水的制備、收集和保存
        4.2.3 二步法純化Ig G2a亞型的HPV16 E7 蛋白單克隆抗體單抗69E2
        4.2.4 二步法-辛酸-硫酸銨沉淀加Protein A的方案純化Ig M亞型單抗69A6
        4.2.5 四步法-硫酸銨沉淀+凝膠過濾層析+IgM柱+凝膠過濾層析的方案純化Ig M亞型單抗79A11
        4.2.6 間接ELISA測定純化后的HPV16 E7 蛋白單克隆抗體的效價
    4.3 討論
        4.3.1 HPV16E7蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株的建立
        4.3.2 陽性克隆雜交瘤細胞株的篩選方法的建立
        4.3.3 飼養(yǎng)層細胞的制備
        4.3.4 細胞融合
        4.3.5 雜交瘤細胞株的HAT選擇性培養(yǎng)
        4.3.6 陽性克隆的篩選
        4.3.7 克隆化
        4.3.8 HPV16E7蛋白單克隆抗體腹水的制備
        4.3.9 HPV16E7蛋白單克隆抗體腹水的保存
        4.3.10 Ig G2a和 Ig M亞型的HPV16 E7 蛋白單克隆抗體的純化
        4.3.11 ELISA檢測純化后的HPV16 E7 蛋白單克隆抗體的效價
    4.4 小結(jié)
第5章 HPV16E7蛋白單克隆抗體的表征
    5.1 材料和方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 方法
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 8株HPV16E7蛋白單克隆抗體的配對
        5.2.2 HPV16E7蛋白單克隆抗體的亞型和氨基酸序列測定
        5.2.3 2株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11和69E2 的親和力測定
        5.2.4 3株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11、69E2和69A6 的表位鑒定
        5.2.5 3株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11、69E2和69A6 的特異性表位的保守性分析
    5.3 討論
        5.3.1 8株HPV16E7蛋白單克隆抗體的配對
        5.3.2 3株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11、69E2和69A6 的核苷酸序列的測定和氨基酸序列的預(yù)測
        5.3.3 2株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11和69E2 的親和力測定
        5.3.4 3株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11、69E2和69A6 的表位比較
        5.3.5 3株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11、69E2、69A6 的特異性表位的保守性分析
    5.4 小結(jié)
第6章 HPV16 E7 蛋白單抗在免疫組化、免疫熒光和Western Blot中的診斷應(yīng)用
    6.1 材料與方法
        6.1.1 材料
        6.1.2 方法
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 8株HPV16 E7 單克隆抗體與HIS-c-Myc蛋白的Western Blot反應(yīng)
        6.2.2 8株HPV16E7單克隆抗體在免疫細胞化學(xué)中的診斷應(yīng)用
        6.2.3 3株HPV16 E7 單克隆抗體79A11、69E2和69A6 在免疫組織化學(xué)中的診斷應(yīng)用
        6.2.4 3株HPV16 E7 單克隆抗體79A11、69E2和69A6 在間接免疫熒光中的診斷應(yīng)用
        6.2.5 3株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11、69E2和69A6與Ca Ski和HeLa細胞的總蛋白的Western Blot反應(yīng)
    6.3 討論
        6.3.1 8株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體與HIS-c-Myc蛋白的Weastern Blot反應(yīng)
        6.3.2 3株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11、69E2和69A6 在免疫細胞化學(xué)中的診斷應(yīng)用
        6.3.3 3株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11、69E2和69A6 在免疫組織化學(xué)中的診斷應(yīng)用
        6.3.4 3株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11、69E2和69A6 在間接免疫熒光中的診斷應(yīng)用
        6.3.5 3株HPV16 E7 蛋白單克隆抗體79A11、69E2和69A6在Western Blot中的診斷應(yīng)用
    6.4 小結(jié)
第7章 定量檢測HPV16 E7 蛋白的常規(guī)雙抗夾心ELISA法的建立
    7.1 材料與方法
        7.1.1 材料
        7.1.2 方法
    7.2 結(jié)果與分析
        7.2.1 間接ELISA檢測捕獲抗體79A11 和檢測抗體69E2 的效價
        7.2.2 直接ELISA檢測偶聯(lián)物HRP-69E2 的抗體效價
        7.2.3 封閉條件的優(yōu)化
        7.2.4 雙抗夾心ELISA的棋盤實驗
        7.2.5 抗原HPV16E7蛋白與捕獲抗體79A11反應(yīng)時間的優(yōu)化
        7.2.6 抗原HPV16 E7 蛋白在ng^μg級以3 倍稀釋法稀釋時的線性關(guān)系
        7.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng級以等比等差法稀釋時的線性關(guān)系和定量限
    7.3 討論
    7.4 小結(jié)
第8章 單抗在化學(xué)發(fā)光免疫分析方法中定量檢測HPV16E7蛋白的診斷應(yīng)用
    8.1 材料與方法
        8.1.1 材料
        8.1.2 方法
    8.2 結(jié)果與分析
        8.2.1 間接ELISA測定單抗79A11和69E2 的抗體效價
        8.2.2 直接ELISA測定檢測抗體偶聯(lián)物Biotin-69E2 的抗體效價
        8.2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的原理
        8.2.4 捕獲抗體79A11 和檢測抗體Biotin-69E2 的最適工作濃度優(yōu)化
        8.2.5 抗原HPV16E7蛋白與捕獲抗體反應(yīng)的時間優(yōu)化
        8.2.6 封閉條件的優(yōu)化
        8.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng級以等比等差法稀釋
        8.2.8 抗原HPV16 E7 蛋白在μg級以等比等差法稀釋
        8.2.9 抗原在ng^μg級以3倍法稀釋
        8.2.10 制備參考曲線和檢測臨床標本
    8.3 討論
    8.4 小結(jié)
第9章 全文總結(jié)
    9.1 HPV16E7蛋白的制備
    9.2 HPV16E7蛋白單克隆抗體的制備
    9.3 HPV16E7蛋白單克隆抗體的表征
    9.4 3株單抗79A11、69E2和69A6 定性檢測HPV16 E7 蛋白的診斷應(yīng)用
    9.5 2株單抗79A11和69E2 定量檢測HPV16 E7 蛋白的診斷應(yīng)用
論文創(chuàng)新點
不足和展望
參考文獻
博士期間發(fā)表文章及課題參研情況
致謝



本文編號：3946195