發(fā)布時(shí)間：2017-05-24 12:10

  本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞周期因子FoxM1促進(jìn)肝臟再殖的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近二十年來(lái),臨床上一直致力于開展肝細(xì)胞移植技術(shù)的研究。作為原位肝移植(orthotopic liver transplantation)的替代方案,肝細(xì)胞移植技術(shù)研究取得了一定成效。然而,由于移植的肝細(xì)胞在宿主肝臟內(nèi)增殖緩慢,存活時(shí)間有限,并且隨宿主自身肝細(xì)胞的更新而減少,治療性肝臟再殖(therapeutic liver repopulation)仍難以實(shí)現(xiàn)。建立有效的肝細(xì)胞治療方案仍然存在很大的困難,是目前肝細(xì)胞移植技術(shù)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題之一。肝臟再殖是移植的外源細(xì)胞及其所增殖的子代細(xì)胞參與受損肝臟結(jié)構(gòu)的修復(fù),并正常地發(fā)揮肝細(xì)胞生理功能的現(xiàn)象。外源供體細(xì)胞能夠留存于受體肝臟內(nèi)并在數(shù)量與功能上具有治療意義的基本前提是移植的供體細(xì)胞要比內(nèi)源肝細(xì)胞具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)或生存優(yōu)勢(shì)�；诂F(xiàn)有的認(rèn)識(shí),這一前提可以通過(guò)兩種策略來(lái)實(shí)現(xiàn)：一是抑制受體中內(nèi)源肝細(xì)胞的增殖。例如,采用倒千里光堿等化學(xué)物質(zhì)抑制受體肝細(xì)胞的增殖,以及應(yīng)用受體肝細(xì)胞具有遺傳性缺陷的uPA小鼠或Fah基因剔除小鼠模型等。然而,以上模型都是通過(guò)誘發(fā)自身肝細(xì)胞的死亡從而獲得適于移植肝細(xì)胞增殖的肝臟微環(huán)境,這些方法盡管作為研究肝臟再殖的模型能夠在動(dòng)物中實(shí)現(xiàn),然而在臨床應(yīng)用中卻是不可行的。二是增強(qiáng)移植肝細(xì)胞在受體肝臟中的生長(zhǎng)或生存優(yōu)勢(shì)。這種新策略的基本思路是通過(guò)調(diào)節(jié)移植肝細(xì)胞中細(xì)胞周期因子的表達(dá),促進(jìn)其內(nèi)在的增殖能力,增強(qiáng)移植肝細(xì)胞對(duì)損傷肝臟的再殖能力。因此,如何選擇有效的細(xì)胞周期調(diào)控因子是目前該領(lǐng)域的關(guān)鍵問(wèn)題；其次,利用什么樣的載體和方式穩(wěn)定、有效地調(diào)控肝細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞周期因子的表達(dá)也是目前面臨的重要問(wèn)題；同時(shí),上調(diào)細(xì)胞周期因子是否會(huì)帶來(lái)成瘤風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題是必須考慮的安全性問(wèn)題。本研究探討并嘗試解決這些重要科學(xué)問(wèn)題。Fox轉(zhuǎn)錄因子超家族成員FoxMl作為細(xì)胞周期G1/S和G2/M進(jìn)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,是負(fù)責(zé)啟動(dòng)細(xì)胞增殖的必需基因。研究發(fā)現(xiàn),FoxM1可以調(diào)控G1/S進(jìn)程中必需蛋白質(zhì)如Skp2、Cks1、p21、p27和Cdc25A的表達(dá),同時(shí)也可調(diào)控有絲分裂相關(guān)蛋白如Cyclin B、Cdc25B、Survivin、Aurora B激酶、Polo-like激酶1、CENP-A、 CENP-B和CENP-F的表達(dá)。此外,提高FoxMl的表達(dá)能降低細(xì)胞周期抑制因子p27的表達(dá)水平,從而增加細(xì)胞周期激動(dòng)劑如Cdc25B的水平,進(jìn)而促進(jìn)肝臟再生。進(jìn)行部分肝切后,以生長(zhǎng)激素處理來(lái)誘導(dǎo)高齡小鼠的FoxM1表達(dá),可恢復(fù)其正常的肝再生能力,而通過(guò)腺病毒載體介導(dǎo)FoxM1的瞬時(shí)表達(dá)也可達(dá)到相同的效果。FoxM1過(guò)表達(dá)的小鼠部分肝切后,持續(xù)表達(dá)FoxM1的肝細(xì)胞與野生型肝細(xì)胞相比,至少提前8小時(shí)進(jìn)入S期,這種增殖優(yōu)勢(shì)與DNA復(fù)制及有絲分裂必需基因的提前激活有關(guān)。在部分肝切誘導(dǎo)的小鼠肝再生過(guò)程中,FoxM1失活可降低肝細(xì)胞DNA的復(fù)制水平、阻滯細(xì)胞的有絲分裂。更重要的是,肝甲狀腺素結(jié)合蛋白啟動(dòng)子(TTR)調(diào)控FoxM1在肝組織中的長(zhǎng)期表達(dá)并不導(dǎo)致自發(fā)性肝細(xì)胞癌的產(chǎn)生；以二甲基硝胺／苯巴比妥(DEN/PB)作為肝細(xì)胞癌發(fā)生的誘導(dǎo)劑,肝臟持續(xù)表達(dá)FoxM1的小鼠與野生型小鼠相比,其肝癌發(fā)生率及程度并無(wú)差別。這都表明TTR-FoxM1轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞中FoxM1的穩(wěn)定表達(dá)并不會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的發(fā)生�；谝陨详P(guān)于"FoxMl可以促進(jìn)肝細(xì)胞增殖而不會(huì)誘發(fā)腫瘤”的發(fā)現(xiàn),我們推測(cè)FoxM1可能是一個(gè)可以用于提高外源肝細(xì)胞在損傷肝臟中再殖水平的細(xì)胞周期因子。因此,本研究選擇FoxMl作為本研究的目的基因,通過(guò)在移植肝細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FoxM1基因,探討其促進(jìn)肝細(xì)胞肝臟再殖能力的作用。為探討活體內(nèi)持續(xù)表達(dá)FoxMl的肝細(xì)胞是否可以增強(qiáng)肝臟再殖的能力,我們首先采用TTR-FoxM1轉(zhuǎn)基因小鼠模型,獲得FoxM1持續(xù)表達(dá)的肝細(xì)胞,進(jìn)行肝臟再殖能力的檢測(cè)。然后,將相同數(shù)量的TTR-FoxM1肝細(xì)胞和野生型肝細(xì)胞分別移植,或通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性再殖實(shí)驗(yàn)混合移植,進(jìn)入檢驗(yàn)肝臟再殖的理想模型——FAH基因剔除小鼠(Fah-/-小鼠),在不同時(shí)間點(diǎn)分析兩種細(xì)胞肝臟再殖的效率。結(jié)果顯示,FoxM1持續(xù)表達(dá)的TTR-FoxM1肝細(xì)胞在相同時(shí)間點(diǎn)完成的再殖程度更高,再殖損傷肝臟的能力比野生型肝細(xì)胞提高了1.5倍,并且比野生型肝細(xì)胞提前2周完成肝再殖。同時(shí),我們將相同數(shù)量的TTR-FoxM1肝細(xì)胞和野生型肝細(xì)胞移植到2/3肝切的小鼠模型中,在急性肝損傷模型中評(píng)價(jià)肝臟再殖能力。結(jié)果顯示,表達(dá)FoxM1的TTR-FoxM1肝細(xì)胞的肝臟再殖效率為5%-9%,而野生型肝細(xì)胞的再殖效率不超過(guò)2%。這些結(jié)果表明,活體內(nèi)FoxM1過(guò)表達(dá)的肝細(xì)胞具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)和生存優(yōu)勢(shì)�；贔oxM1的高表達(dá)可以提高肝細(xì)胞在活體內(nèi)再殖肝臟能力的特性,我們進(jìn)一步探討了如何賦予肝細(xì)胞FoxM1高表達(dá)特性的技術(shù)策略。通過(guò)DNA運(yùn)載系統(tǒng)載體改造野生型肝細(xì)胞,從而獲得FoxM1持續(xù)表達(dá)的肝細(xì)胞,這是開展臨床應(yīng)用的必經(jīng)途徑。因此,本研究引入能整合基因組并能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)目的基因的非病毒載體一—Sleeping Beauty (SB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng),構(gòu)建了FoxM1 SB載體。在前期工作中,基于Fah-/-小鼠的肝臟再殖特性,我們建立了應(yīng)用SB載體同時(shí)將多個(gè)基因?qū)敫螌?shí)質(zhì)細(xì)胞的技術(shù)體系。根據(jù)前期工作的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ),我們采用液體壓力法將FoxM1 SB載體注射至Fah-/-小鼠尾靜脈,對(duì)注射后獲得的FoxM1穩(wěn)定表達(dá)的肝細(xì)胞進(jìn)行增殖能力和肝臟再殖能力的分析,從而評(píng)價(jià)SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)傳遞FoxM1基因修飾肝細(xì)胞的有效性及穩(wěn)定表達(dá)FoxM1肝細(xì)胞的增殖能力。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),SB載體介導(dǎo)的FoxM1穩(wěn)定表達(dá)(SB-FoxM1)的肝細(xì)胞與野生型肝細(xì)胞相比,在相同時(shí)間內(nèi)肝臟再殖程度更高,與前一部分TTR-FoxM1轉(zhuǎn)基因小鼠模型的結(jié)果相似。通過(guò)活體生物熒光成像技術(shù),我們證明了SB-FoxM1穩(wěn)定表達(dá)的肝細(xì)胞比野生型肝細(xì)胞提前2周完成肝再殖。同樣,將SB-FoxM1穩(wěn)定表達(dá)的肝細(xì)胞移植到2/3肝切急性肝損傷小鼠模型中,能夠?qū)崿F(xiàn)4%-9%(最高15%)的肝臟再殖。在體外實(shí)驗(yàn)中,體外培養(yǎng)的SB-FoxM1肝細(xì)胞比野生型肝細(xì)胞具有更高BrdU摻入陽(yáng)性細(xì)胞比例。此外,我們還檢測(cè)了兩種細(xì)胞中Ki67和PCNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)SB-FoxM1肝細(xì)胞具有增強(qiáng)的增殖活性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,應(yīng)用SB載體可有效地傳遞FoxM1基因,穩(wěn)定表達(dá)FoxM1的肝細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng),在慢性和急性肝損傷模型小鼠中再殖損傷肝臟的能力都較野生型肝細(xì)胞有顯著地提升。同時(shí),我們通過(guò)直接體外轉(zhuǎn)染新鮮分離的肝細(xì)胞,獲得表達(dá)FoxM1的肝細(xì)胞,并對(duì)其進(jìn)行肝臟再殖能力的檢測(cè)與分析。通過(guò)再殖實(shí)驗(yàn),我們證明了直接體外轉(zhuǎn)染FoxM1質(zhì)粒的肝細(xì)胞也具有更強(qiáng)的肝臟再殖能力。這種體外修飾成熟肝臟細(xì)胞,從而使其獲得更強(qiáng)的肝臟再殖能力的方法具有更大的臨床應(yīng)用價(jià)值。上調(diào)細(xì)胞周期因子是否會(huì)引起組織的異常增生甚至誘發(fā)腫瘤,這是必須考慮的安全性問(wèn)題。我們通過(guò)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),持續(xù)表達(dá)FoxM1細(xì)胞移植后再殖的受體肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；通過(guò)貫序移植及在體長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)實(shí)驗(yàn)都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生；通過(guò)激光捕獲顯微切割技術(shù)獲取FoxM1表達(dá)肝細(xì)胞移植后重建的受體肝臟組織,進(jìn)一步檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FoxM1沒(méi)有誘發(fā)腫瘤形成。這些證據(jù)表明,利用非病毒SB載體調(diào)控FoxM1表達(dá)的方式可以安全地應(yīng)用于增強(qiáng)肝細(xì)胞增殖能力的研究中。綜上所述,本研究證明了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子FoxM1具有增強(qiáng)肝細(xì)胞增殖能力和促進(jìn)肝臟再殖的作用。作為本研究的創(chuàng)新點(diǎn),我們首次利用非病毒載體傳遞FoxM1基因的技術(shù)體系,避免了病毒載體所帶來(lái)的內(nèi)源性病毒重組、插入激活和免疫反應(yīng)強(qiáng)等不安全因素,這在一定程度上增加了在人類肝臟疾病細(xì)胞治療中的實(shí)用性。此外,本研究還證明了通過(guò)遺傳修飾使FoxM1高表達(dá)的肝細(xì)胞不會(huì)誘發(fā)腫瘤。本研究的開展,為解決移植肝細(xì)胞在宿主肝臟內(nèi)增殖緩慢的問(wèn)題提供了一個(gè)新的思路。
【關(guān)鍵詞】：肝細(xì)胞移植 FoxM1 肝臟再殖 Sleeping beauty轉(zhuǎn)座系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R657.3
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-19
• 一、肝細(xì)胞移植治療的研究現(xiàn)狀13-14
• 二、提高肝細(xì)胞移植治療效果的策略14-15
• 三、轉(zhuǎn)錄因子FoxM1的研究現(xiàn)狀15-19
• 實(shí)驗(yàn)材料19-27
• 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19-20
• 二、儀器與試劑20-27
• 實(shí)驗(yàn)方法27-41
• 一、TTR-FoxM1小鼠肝細(xì)胞的分離、移植及肝臟再殖27-31
• 二、通過(guò)載體獲得FoxM1持續(xù)表達(dá)的小鼠肝細(xì)胞31-33
• 三、FoxM1持續(xù)表達(dá)的肝細(xì)胞的肝臟再殖實(shí)驗(yàn)33-35
• 四、肝細(xì)胞增殖和肝再殖能力的檢測(cè)35-39
• 五、FoxM1持續(xù)表達(dá)的細(xì)胞致瘤性的檢測(cè)39-40
• 六、統(tǒng)計(jì)和分析40-41
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-63
• 一、持續(xù)表達(dá)FOXM1的TTR-FOXM1轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞具有更強(qiáng)的肝臟再殖能力41-46
• 二、Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)獲得穩(wěn)定表達(dá)FOXM1的肝細(xì)胞并具有更強(qiáng)的肝臟再殖能力46-59
• 三、小鼠肝臟中持續(xù)表達(dá)FOXM1的肝細(xì)胞沒(méi)有成瘤風(fēng)險(xiǎn)59-63
• 討論63-67
• 一、通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)染或體外轉(zhuǎn)染能有效上調(diào)小鼠肝細(xì)胞中FoxM1表達(dá)64
• 二、過(guò)表達(dá)FoxM1的肝細(xì)胞能更快完成損傷肝臟的再殖64-65
• 三、肝細(xì)胞過(guò)表達(dá)FoxM1不會(huì)誘發(fā)腫瘤65-66
• 四、研究中存在的問(wèn)題與不足66-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 綜述74-79
• 參考文獻(xiàn)76-79
• 發(fā)表文章：肝干細(xì)胞的幾個(gè)生物學(xué)問(wèn)題79-86
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表和參與發(fā)表的部分論文86-88
• 致謝88-89

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 金彩霞;肝原始細(xì)胞系LEPCs向胰腺β細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化潛能研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

  本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞周期因子FoxM1促進(jìn)肝臟再殖的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：390722