本文關(guān)鍵詞：登革病毒包膜蛋白EDⅢ抗體中和活性與增強(qiáng)活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：登革熱(dengue)是全球蔓延最快的蟲(chóng)媒傳播疾病,通過(guò)感染登革病毒(DENV)蚊子的叮咬在人群中傳播,全世界40%以上約25億人面臨罹患登革熱危險(xiǎn)。感染4種DENV (DENV-1,DENV-2,DENV-3和DENV-4)血清型的其中一種都會(huì)引起廣泛的臨床癥狀,從輕微癥狀或典型登革熱,類似于流感樣癥狀,劇烈頭痛和關(guān)節(jié)肌肉痛；到小部分患者出現(xiàn)威脅生命的重癥登革熱,曾稱為登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)或登革休克綜合征(dengue shock Syndrome, DSS)。登革熱的傳播常發(fā)生在全球熱帶和亞熱帶氣候的城市和城郊地區(qū),已成為一個(gè)主要國(guó)際公共衛(wèi)生的重要問(wèn)題。近些年來(lái),東南亞和美洲地區(qū)的登革熱疫情日趨嚴(yán)重,幾乎每年都會(huì)在中國(guó)的廣東、廣西、海南和福建出現(xiàn)不同程度的流行,其中,廣東地區(qū)是高發(fā)地區(qū)。截止2014年,四種血清型的DENV均在我國(guó)發(fā)生過(guò)流行,但是以DENV-1較為常見(jiàn)。2014年6月廣州地區(qū)爆發(fā)近二十年最大規(guī)模的登革熱。世界衛(wèi)生組織于2014年強(qiáng)調(diào),目前登革熱沒(méi)有有效的治療手段和疫苗,只能夠通過(guò)減少及控制傳播媒介蚊子的傳播、避免遭受叮咬的個(gè)人防護(hù)措施預(yù)防登革熱的傳播和發(fā)展。因此,本研究的意義在于能夠?qū)σ呙绾蜻x及其安全性評(píng)估有所幫助。DENV基因組是單股RNA鏈(大約1lkb),包含單個(gè)開(kāi)放讀碼框,編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白包括衣殼蛋白(capsid, C)、前膜/膜蛋白(premembrane/membrane, prM/M)和包膜蛋白(envelope, E);七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein, NS)包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、 NS4B和NS5。多聚蛋白的合成在細(xì)胞質(zhì)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上完成。E糖蛋白是成熟病毒顆粒主要外露蛋白,以頭尾相連的90個(gè)E蛋白二聚體平鋪于病毒顆粒表面脂質(zhì)雙分子層中。外功能區(qū)劃分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域和功能域：EDⅠ, EDⅡ, EDⅢ。E蛋白與病毒附著,融合,細(xì)胞趨向以及保護(hù)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)。黃病毒屬病毒代表致病性基因標(biāo)志大部分位于E蛋白基因。其中,EDⅢ包含免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)樣域,形成7股Ig樣折疊,介導(dǎo)病毒與附著宿主細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)之間的相互作用,是中和抗體識(shí)別的關(guān)鍵表位。DENVE蛋白氨基酸序列同源性高,且是保守的。每種血清型的E蛋白氨基酸序列最小相似性為90%～96%,血清型間E蛋白氨基酸序列相似性一般為60～70%。針對(duì)DENV EDⅢ蛋白以及其相應(yīng)抗體功能研究一直是登革熱研究熱點(diǎn),大量關(guān)于EDⅢ及其抗體的動(dòng)物性實(shí)驗(yàn)研究表明針對(duì)四種血清型強(qiáng)烈的中和保護(hù)性的EDⅢ抗體,其識(shí)別表位主要位于EDⅢ的側(cè)脊和A鏈區(qū)。然而,近些年有研究表明,存在于DENV感染人血清中EDⅢ抗體的中和保護(hù)性和增強(qiáng)感染的作用是微弱的,亦有研究表明DENV感染人血清和鼠EDⅢ抗體所識(shí)別的表位是相似的。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1以多聚體的形式分布于細(xì)胞不同區(qū)域,可以分為膜型和分泌型兩種形式,分泌到細(xì)胞外的NS1以六聚體形式存在。NS1蛋白參與感染細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和病毒復(fù)制。NS1蛋白能夠作為一個(gè)重要的早期診斷的生物標(biāo)志物,研究表明DENV感染患者在感染早期階段的高濃度。NS1蛋白與后繼嚴(yán)重疾病的發(fā)生相關(guān)聯(lián),檢測(cè)的NS1蛋白量越高其相應(yīng)疾病越嚴(yán)重。使用DENV NS1抗原捕獲ELISA法檢測(cè)DENV感染患者血清顯示,感染DENV早期患者NS1蛋白分泌量可高達(dá)50ug/ml。因此本研究將其作為評(píng)價(jià)感染程度的評(píng)估指標(biāo)。目前疫苗研究的難點(diǎn)在于,感染一種DENV血清型并恢復(fù)后,機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生的高效價(jià)中和抗體,只對(duì)同型病毒具有終生免疫,但對(duì)此后感染的其他三種血清型病毒只有部分和短暫的交叉免疫。隨后感染其它血清型病毒會(huì)增加罹患重癥登革熱的危險(xiǎn)。重癥表現(xiàn)常見(jiàn)于二次異型DENV感染的患者,盡管少數(shù)初次DENV感染的患者也會(huì)出現(xiàn)。當(dāng)二次DENV感染時(shí),先前存在的非中和或亞中和抗體與病毒表面抗原結(jié)合,促進(jìn)病毒-抗體復(fù)合體進(jìn)入FcyR細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)攝取,進(jìn)而導(dǎo)致大量病毒復(fù)制和嚴(yán)重病理變化,這種現(xiàn)象稱之為抗體依賴性增強(qiáng)(antibody-dependentenhancement, ADE)。正是由于四種DENV血清型感染導(dǎo)致ADE現(xiàn)象的出現(xiàn),嚴(yán)重阻礙了登革疫苗的研發(fā)。理想的DENV疫苗必須對(duì)四種DENV血清型均具有保護(hù)作用；能夠提供終身保護(hù)作用；無(wú)明顯的局部和全身性不良反應(yīng)；對(duì)登革熱疫區(qū)的全部人口具有普遍的有效性且成本低廉。因此,本研究旨在有助于評(píng)估疫苗的增強(qiáng)感染的研究�；谝陨涎芯勘尘�,我們推測(cè),在自然狀態(tài)下,DENV感染機(jī)體后,登革病毒的多種抗原成分均能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答,各種抗原成分在抗原競(jìng)爭(zhēng)中,形成了優(yōu)勢(shì)表位與非優(yōu)勢(shì)表位,但是后者在抗原競(jìng)爭(zhēng)中難以有效地刺激中和保護(hù)性。因此,我們探索非優(yōu)勢(shì)抗原表位是否能夠作為單一的免疫原,刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈中和保護(hù)性且微弱或無(wú)增強(qiáng)感染的抗體。本研究集中在以下三個(gè)方面：一、DENV EDⅢ交叉反應(yīng)單抗識(shí)別表位的關(guān)鍵殘基的確定本團(tuán)隊(duì)前期工作中分別使用四種DENV血清型重組EDⅢ蛋白免疫小鼠,制備了一組抗DENV-1,-2,-3和-4 EDⅢ的單抗,篩選出對(duì)四種血清型DENV有交叉反應(yīng)性的單抗。對(duì)這些單抗進(jìn)行合成重疊多肽掃描分析中發(fā)現(xiàn),大約2/3的交叉反應(yīng)性單抗特異性識(shí)別高度保守的EDⅢ aa310KEVAETQHGT319序列,并且鑒定了這些單抗與重組EDⅢ蛋白結(jié)合能力強(qiáng)但中和活性較為復(fù)雜,表現(xiàn)為對(duì)四種不同血清型DENV出現(xiàn)強(qiáng)烈、中等或無(wú)的中和活性。為了進(jìn)一步明確該氨基酸序列中抗原抗體結(jié)合的關(guān)鍵殘基,我們采用酵母表面展示技術(shù)將DENV EDⅢ蛋白表達(dá)在酵母細(xì)胞表面,并使用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)aa310-319的十個(gè)氨基酸進(jìn)行逐一突變,隨后將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞,獲得十種EDⅢ單點(diǎn)突變蛋白。使用流式細(xì)胞分析EDⅢ交叉反應(yīng)單抗與十種突變體的結(jié)合情況。酵母表面展示技術(shù)是研究可溶性蛋白間相互作用的有效工具,其可以簡(jiǎn)單快速地用于確定抗原與抗體、受體與配基的結(jié)合及相互作用。酵母以其真核細(xì)胞翻譯后蛋白加工修飾的特點(diǎn),使其表達(dá)產(chǎn)物更接近于天然構(gòu)象。體外定點(diǎn)突變則是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系常規(guī)工具,能夠簡(jiǎn)便、快速且高效的獲得改造DNA序列或DNA表達(dá)的目的蛋白,從微觀水平上闡明正常狀態(tài)與突變狀態(tài)的差異性。酵母展示技術(shù)與定點(diǎn)突變技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用,簡(jiǎn)便高效的實(shí)現(xiàn)突變DNA序列在蛋白表現(xiàn)情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),EDⅢ氨基酸序列中的Q316和H317是交叉反應(yīng)EDⅢ單克隆抗體抗原抗體結(jié)合的關(guān)鍵殘基,為進(jìn)一步優(yōu)化修飾EDⅢ亞單位疫苗的策略奠定基礎(chǔ)。二、建立高通量簡(jiǎn)便的方法評(píng)價(jià)DENV抗體的增強(qiáng)功能DENV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體反應(yīng)是一把雙刃劍,有保護(hù)性免疫,也可能加重病情。所以,DENV抗體的研究必須從保護(hù)性能和增強(qiáng)感染性能這兩方面著手。DENVE蛋白是主要的保護(hù)性抗原,也是中和抗體主要的靶向成份。當(dāng)具有中和活性的抗體分子與E蛋白抗原決定簇結(jié)合,阻止E蛋白與靶細(xì)胞結(jié)合或者阻止病毒RNA釋放進(jìn)入易感細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,即發(fā)揮保護(hù)作用。而當(dāng)亞中和或非中和抗體Fc段與細(xì)胞膜上Fcy受體(FcyR)結(jié)合,增加了DENV和細(xì)胞黏附的機(jī)會(huì),從而促使DENV進(jìn)入細(xì)胞,使得細(xì)胞易感�；诟腥綝ENV后NS1蛋白分泌與登革熱疾病的嚴(yán)重程度是密切相關(guān),本團(tuán)隊(duì)前期建立了測(cè)定抗體和血清中和活性的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)微中和實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunospot microneutralization test, ELISPOT-MNT)方法,能夠方便、客觀地評(píng)價(jià)DENV抗體的中和活性。因此,為了更全面評(píng)價(jià)抗體或血清中和保護(hù)性和增強(qiáng)活性,我們建立并評(píng)估ADE技術(shù)是在前期建立的NS1抗原捕獲ELISA檢測(cè)DENVNS1蛋白含量的基礎(chǔ)上,用表達(dá)FcyR的K562細(xì)胞株和已知公認(rèn)的具有增強(qiáng)活性的單抗4G2為陽(yáng)性對(duì)照,建立了高通量簡(jiǎn)便的檢測(cè)登革抗體和血清的ADE檢測(cè)方法(ADE assay based quantitative measurement of NS1 antigen capture ELISA, ELISA-ADE)。即使用傳統(tǒng)病毒滴度測(cè)定方法平行驗(yàn)證NS1抗原定量新ELISA-ADE方法檢測(cè)4G2增強(qiáng)感染時(shí)的NS1蛋白含量是否具有一致性,經(jīng)過(guò)Spearman相關(guān)分析表明,兩種方法顯著相關(guān)。隨后,使用ELISPOT-MNT和ELISA-ADE方法檢測(cè)了4G2和6份DENV-1感染患者恢復(fù)期血清的中和活性和增強(qiáng)活性,發(fā)現(xiàn)4G2和患者血清的增強(qiáng)峰值均出現(xiàn)在亞中和濃度,符合公認(rèn)的中和與增強(qiáng)濃度關(guān)系,進(jìn)一步驗(yàn)證ELISA-ADE方法學(xué)的可靠性。并且分析了前期制備具有強(qiáng)烈中和活性的交叉反應(yīng)EDⅢ單克隆抗體2D73和3E31的中和活性與增強(qiáng)活性的關(guān)系。結(jié)果顯示,2D73的ADE增強(qiáng)感染峰值同樣出現(xiàn)在亞中和濃度下,而3E31僅有微弱或無(wú)增強(qiáng)感染的效應(yīng)。提示3E31具有作為免疫治療性抗體的潛能。三、 DENV-1感染患者血清和兔抗EDⅢ血清的EDⅢ反應(yīng)抗體的功能研究DENV EDⅢ是中和抗體的靶標(biāo),是有潛力的登革疫苗的候選者。然而,近些年研究表明DENV感染人血清中的EDⅢ抗體僅占DENV總抗體的一小部分,其中和活性和增強(qiáng)活性作用微弱。但我們分析認(rèn)為：在DENV自然感染中,多種DENV抗原可誘導(dǎo)產(chǎn)生多克隆多特異性抗體,有些誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)的表位未必是優(yōu)勢(shì)表位,因而在抗原競(jìng)爭(zhēng)中處于弱勢(shì)而不能產(chǎn)生足量的保護(hù)性抗體。針對(duì)這種情況可利用純化的亞單位疫苗來(lái)避免抗原競(jìng)爭(zhēng)而誘導(dǎo)有效的保護(hù)性反應(yīng)。國(guó)外多數(shù)DENV感染患者血清的EDⅢ抗體的研究集中在DENV-2和-3感染,而中國(guó)南方地區(qū)60%的DENV感染為DENV-1。本研究用重組DENV-1EDⅢ免疫新西蘭白兔制備抗EDⅢ多克隆免疫兔血清,全面分析了抗EDⅢ兔血清與DENV-1感染患者恢復(fù)期血清中EDⅢ反應(yīng)抗體的中和保護(hù)作用與ADE效應(yīng),探索EDⅢ作為亞單位疫苗候選抗原的可能性。我們分析了30份DENV-1感染患者恢復(fù)期血清的中和活性與EDⅢ結(jié)合抗體滴度的關(guān)系,使用Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果顯示患者血清與EDⅢ蛋白結(jié)合的抗體滴度遠(yuǎn)低于中和滴度,且兩者不相關(guān)；說(shuō)明EDⅢ抗體與DENV感染的中和保護(hù)性沒(méi)有關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步從30份患者血清中,隨機(jī)挑選6份去除患者血清中EDⅢ反應(yīng)抗體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)去除EDⅢ抗體前后,患者血清對(duì)同型和異型DENV的中和活性與增強(qiáng)活性均沒(méi)有變化。說(shuō)明DENV感染患者血清中EDⅢ抗體作用微弱,與其他研究團(tuán)隊(duì)結(jié)果相一致。兔抗DENV-1 EDⅢ血清對(duì)同型DENV的中和活性為較高稀釋度1：50,000,增強(qiáng)活性較低為1：5,000；值得注意的是,兔抗EDⅢ血清對(duì)異型DENV感染的增強(qiáng)峰值僅為1：40,這提示EDⅢ免疫原免疫兔子,體內(nèi)產(chǎn)生的EDⅢ反應(yīng)抗體在二次異型感染中是安全的。去除兔抗EDⅢ血清的EDⅢ反應(yīng)抗體后,中和活性與增強(qiáng)活性全部消失。這說(shuō)明雖然DENV EDⅢ不是登革病毒自然感染過(guò)程中的主要抗原,但是純化或重組的DENV EDⅢ仍然能夠作為亞單位疫苗,刺激有效安全的免疫應(yīng)答反應(yīng)。小結(jié)本課題使用酵母表面展示蛋白技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù),獲得EDⅢ交叉反應(yīng)性抗體特異性識(shí)別高度保守的aa310-319序列的關(guān)鍵殘基,位于EDⅢ蛋白AB環(huán)的Q316和H317。為了全面評(píng)估DENV抗體和血清的增強(qiáng)感染的性能,首次建立基于NS1蛋白捕獲ELISA的ADE檢測(cè)(ELISA-ADE)方法,在96孔板上實(shí)施高通量簡(jiǎn)便的檢測(cè),與前期建立的檢測(cè)中和性能ELISPOT-MNT方法學(xué)聯(lián)合運(yùn)用,全面評(píng)價(jià)DENV抗體和血清的增強(qiáng)和中和保護(hù)性能。這進(jìn)一步為探索免疫治療性抗體,以及評(píng)估DENV疫苗的安全性和有效性提供有效的、高通量、簡(jiǎn)便的技術(shù)手段。在前期建立穩(wěn)定方法學(xué)的基礎(chǔ)上,使用重組DENVEDⅢ蛋白免疫家兔,獲得抗EDⅢ的兔多克隆抗體血清,證實(shí)抗DENV-1 EDⅢ兔血清中的EDⅢ反應(yīng)抗體在中和活性和增強(qiáng)活性中起關(guān)鍵作用,并且抗EDⅢ兔血清對(duì)二次異型DENV感染是安全的。同時(shí)印證了DENV-1感染患者恢復(fù)期血清中EDⅢ抗體的中和與增強(qiáng)功能甚微。這提示雖然DENV EDⅢ在登革病毒自然感染過(guò)程中的不是關(guān)鍵保護(hù)與增強(qiáng)作用的免疫原,但是純化或重組的DENY EDⅢ仍然能夠作為有潛力的亞單位疫苗,刺激有效安全的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：登革病毒 包膜蛋白Ⅲ區(qū) 中和活性 抗體依賴的增強(qiáng)作用 感染血清 兔血清
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R446.6
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-26
• 第一章 DENV EDⅢ交叉反應(yīng)單克隆抗體識(shí)別表位的關(guān)鍵殘基的確定26-47
• 1 材料與方法27-40
• 2 結(jié)果40-44
• 3 討論44-46
• 4 小結(jié)46-47
• 第二章 建立高通量簡(jiǎn)便的方法評(píng)價(jià)DENV抗體和血清的增強(qiáng)功能47-72
• 1 材料與方法48-61
• 2 結(jié)果61-68
• 3 討論68-71
• 4 小結(jié)71-72
• 第三章 DENV-1感染患者血清和兔抗EDⅢ血清的EDⅢ抗體的功能研究72-99
• 1 材料與方法72-81
• 2 結(jié)果81-96
• 3 討論96-97
• 4 小結(jié)97-99
• 全文總結(jié)99-101
• 參考文獻(xiàn)101-109
• 中英文縮寫(xiě)詞109-112
• 在讀期間發(fā)表及待發(fā)表的文章112
• 在讀期間所獲獎(jiǎng)勵(lì)112-113
• 致謝113-114

  本文關(guān)鍵詞：登革病毒包膜蛋白EDⅢ抗體中和活性與增強(qiáng)活性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：385080