本文關(guān)鍵詞：質(zhì)子感知GPCRs對MEF細(xì)胞遷移的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本項研究首次針對胞外酸性環(huán)境對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF細(xì)胞)信號通路的影響及其分子機制進行較全面的研究。胞外酸性環(huán)境已被報道能夠在多種細(xì)胞中通過活化存在于細(xì)胞膜表面的質(zhì)子感知G蛋白偶聯(lián)受體或是離子通道,激活多條胞內(nèi)信號通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。通過這種調(diào)控機制,胞外酸性環(huán)境在癌癥、哮喘等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此,研究胞外酸性對不同類型細(xì)胞的信號通路的影響及其分子機制將會領(lǐng)引我們發(fā)現(xiàn)更多新的治療疾病的靶標(biāo),為相關(guān)疾病的治療和藥物開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。本研究分別采用野生型C57BL/6小鼠來源的MEF細(xì)胞,TDAG8TP/TP,OGR1geo/geo和GPR4基因敲除C57BL/6小鼠來源的MEF細(xì)胞作為研究對象。運用細(xì)胞遷移、細(xì)胞存活率測定、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測定等實驗方法檢測胞外酸性環(huán)境對于MEF細(xì)胞信號通路的影響。采用Real-Time PCR技術(shù)檢測四種質(zhì)子感知的G蛋白偶聯(lián)受體(OGR1、 GPR4、TDAG8和G2A) mRNA在野生型MEF細(xì)胞中的表達(dá)水平。Western blotting被用于檢測在野生型MEF中,OGR1、GPR4、TDAG8和G2A的蛋白表達(dá)量及胞外酸性刺激MEF細(xì)胞后,細(xì)胞遷移相關(guān)信號通路中的Aktl和p38MAPK蛋白的磷酸化水平,探討胞外酸性誘導(dǎo)MEF細(xì)胞遷移的胞內(nèi)信號通路。借助SPSS13.0軟件進行實驗組和對照組之間的單因素方差分析(ANOVA)和分別來源于野生型小鼠,TDAG8TP/TP, OGR1geo/geo和GPR4基因敲除小鼠的MEF細(xì)胞遷移數(shù)理論值和實際值之間的配對t檢驗。P0.05為具有顯著性差異。本項研究首先檢測胞外酸性環(huán)境對MEF細(xì)胞遷移的影響及對不同生長因子(IGF-1、EGF和PDGF)誘導(dǎo)的MEF細(xì)胞遷移的影響。細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示,胞外酸性促進MEF細(xì)胞的遷移,且特異性地增力PDGF誘導(dǎo)的MEF細(xì)胞的遷移。隨后,本研究進一步檢測胞外酸性對MEF細(xì)胞存活力和增殖的影響,探尋上述實驗結(jié)果是否與MEF細(xì)胞存活力和增殖的改變相關(guān)。MTT實驗和BrdU實驗結(jié)果顯示,在PDGF存在或是不存在的情況下,胞外酸性均抑制MEF細(xì)胞的存活力和增殖,提示胞外酸性促進MEF細(xì)胞的遷移及促進PDGF誘導(dǎo)的MEF細(xì)胞的遷移通過質(zhì)子感知機制。抑制劑實驗揭示,無論PDGF存在與否,百日咳毒素(PTX),一種Gi蛋白特異性抑制劑,完全抑制胞外酸性誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移,而YM254890,一種Gq蛋白的特異性抑制劑,未能抑制胞外酸性促進的MEF細(xì)胞的遷移,提示Gi蛋白,而不是Gq蛋白,參與胞外酸性促進的細(xì)胞遷移和胞外酸性促進的PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。Western blotting實驗結(jié)果顯示,在PDGF存在或不存在的情況下,與pH 7.6饑餓培養(yǎng)基相比,pH 6.8饑餓培養(yǎng)基刺激MEF細(xì)胞后,磷酸化的P38MAPK蛋白表達(dá)明顯增強。為了驗證胞外酸性促進PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移是否是PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和胞外酸性誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的加性效應(yīng),我們分析了本研究中34次獨立的野生型MEF細(xì)胞遷移實驗數(shù)據(jù),采用配對t檢驗方法(SPSS13.0軟件)進行統(tǒng)計學(xué)分析。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,pH 6.8和PDGF對MEF細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)不是加性的(t=7.72,d.f.=33,p=0.000),它們之間存在協(xié)同作用。當(dāng)pH 6.8與PDGF同時刺激MEF細(xì)胞后,MEF細(xì)胞的遷移數(shù)是pH 6.8和PDGF分別刺激MEF細(xì)胞遷移數(shù)之和的1.5倍。胞內(nèi)鈣離子濃度測定實驗結(jié)果揭示,胞外酸性促進MEF細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬時升高,且這一過程受到Gq蛋白調(diào)控。通過分別使用OGR1-, GPR4-,和TDAG8-KO的MEF細(xì)胞,結(jié)合Real-time PCR、Western blotting實驗證實,已知的質(zhì)子感知GPCRs(包括OGR1、GPR4、TDAG8和G2A)和質(zhì)子感知的離子通道TRPV1不可能參與胞外酸性誘導(dǎo)的MEF細(xì)胞的遷移及胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。本項研究得出結(jié)論：胞外酸性通過質(zhì)子感知受體／Gi/p38MAPK信號通路,單獨或協(xié)同PDGF促進MEF遷移,而質(zhì)子感知受體/Gq／鈣信號通路不參與此過程；已知的質(zhì)子感知GPCRs(OGR1、GPR4、TDAG8和G2A)和質(zhì)子感知離子通道TRPV1均不參與酸性誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移及[Ca2+],的升高。本項研究結(jié)果證實,除了已知的四種質(zhì)子感知受體外,還存在其他新的質(zhì)子感知GPCR。
【關(guān)鍵詞】：胞外酸性 質(zhì)子感知的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs) 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs) 細(xì)胞遷移 胞內(nèi)鈣離子濃度
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-14
• 英文縮寫索引14-17
• 第一章 實驗研究17-68
• 1.1 引言17-20
• 1.2 實驗材料20-23
• 1.2.1 主要試劑與材料20
• 1.2.2 主要儀器與設(shè)備20
• 1.2.3 常用液體的配制20-23
• 1.3 實驗方法23-37
• 1.3.1 小鼠胚胎的制備23
• 1.3.2 MEF細(xì)胞的制備23
• 1.3.3 MEF細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代23-24
• 1.3.4 MEF細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇24
• 1.3.5 細(xì)胞存活力的測定(MTT法)24-25
• 1.3.6 細(xì)胞增殖的測定(BrdU法)25-26
• 1.3.7 細(xì)胞劃痕實驗26-27
• 1.3.8 細(xì)胞遷移實驗(Boyden chamber法)27
• 1.3.9 細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取27-28
• 1.3.10 Western blotting28-30
• 1.3.11 MEF細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測定(Fura-2/AM,鈣離子熒光探針法)30
• 1.3.12 實時熒光定量PCR30-32
• 1.3.13 小鼠尾中提取DNA32-33
• 1.3.14 DNA溶度的檢測及完整性分析33
• 1.3.15 基因敲除小鼠DNA的基因分型檢測(PCR法)33-36
• 1.3.16 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析36-37
• 1.4 實驗結(jié)果37-60
• 1.4.1 胞外酸性對MEF細(xì)胞遷移的影響37-48
• 1.4.1.1 胞外酸性單獨或協(xié)同PDGF促進MEF細(xì)胞遷移37-42
• 1.4.1.2 胞外酸性對MEF細(xì)胞存活率和增殖的影響42-44
• 1.4.1.3 胞外酸性通過Gi蛋白偶聯(lián)受體協(xié)同PDGF促進MEF細(xì)胞遷移44-46
• 1.4.1.4 胞外酸性協(xié)同PDGF促進MEF細(xì)胞遷移通過激活p38MAPK信號通路起作用46-48
• 1.4.2 胞外酸性對MEF胞內(nèi)鈣離子濃度的影響48-51
• 1.4.2.1 胞外酸性促進MEF細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高48-49
• 1.4.2.2 胞外酸性通過Gq蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)MEF胞內(nèi)Ca~(2+)濃度升高49-50
• 1.4.2.3 Gq/11和TRPV1通道均未參與PDGF誘導(dǎo)的MEF胞內(nèi)Ca~(2+)濃度升高50-51
• 1.4.3 MEF細(xì)胞應(yīng)答胞外酸性的質(zhì)子感知機制51-58
• 1.4.3.1 質(zhì)子感知受體在MEF中的表達(dá)51-53
• 1.4.3.2 GPR4、TDAG8、OGR1未參與胞外酸性協(xié)同PDGF促進的細(xì)胞遷移53-55
• 1.4.3.3 TRPV1不參與胞外酸性協(xié)同PDGF促進的細(xì)胞遷移55-56
• 1.4.3.4 OGR1未參與胞外酸性誘導(dǎo)的MEF細(xì)胞胞內(nèi)Ca~(2+)濃度升高56-57
• 1.4.3.5 TRPV1通道均未參與胞外酸性誘導(dǎo)的MEF細(xì)胞胞內(nèi)Ca~(2+)濃度升高57-58
• 1.4.4 實驗結(jié)果總結(jié)58-60
• 1.5 討論60-65
• 1.5.1 胞外酸性通過質(zhì)子感知受體/Gi/p38MAPK信號通路,單獨或協(xié)同PDGF促進MEF遷移,而質(zhì)子感知受體/Gq/鈣信號通路不參與此過程60
• 1.5.2 胞外酸性與PDGF誘導(dǎo)的信號通路通過cross-talk相互作用60-62
• 1.5.3 胞外酸性可能通過Gq/PLC/IP3信號通路促進[Ca~(2+)_i的升高62-63
• 1.5.4 其他新的質(zhì)子感知GPCR存在于MEF細(xì)胞中63-65
• 1.6 結(jié)論65
• 1.7 展望65-68
• 第二章 文獻(xiàn)綜述68-80
• 綜述(一) 胞外酸性與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移68-74
• 綜述(二) 細(xì)胞遷移的信號傳導(dǎo)機制進展74-80
• 參考文獻(xiàn)80-88
• 致謝88-89
• 發(fā)表文章目錄及科研項目89-90

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