本文關(guān)鍵詞：CUL4B通過(guò)抑制p53-ROS正反饋環(huán)減緩壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：p53是重要的抑癌基因,50%以上的人類腫瘤中該基因存在突變,并且純合敲除p53的小鼠可自發(fā)多種腫瘤。該基因編碼的蛋白半衰期很短,使該蛋白維持較低的表達(dá)水平,多種壓力刺激均可激活p53,使該蛋白半衰期延長(zhǎng)�；钚匝�(ROS)是細(xì)胞有氧代謝所產(chǎn)生的一類含氧化合物的總稱,包括羥自由基(.OH)、超氧陰離子(02.-)、過(guò)氧化氫(H202)以及其他多種過(guò)氧化物。ROS可作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的第二信使,參與調(diào)控多種細(xì)胞生理過(guò)程。抑癌基因p53可以調(diào)控ROS水平。生理?xiàng)l件或短暫輕度的壓力刺激下,p53可緩解氧化壓力發(fā)揮抗氧化作用,而較強(qiáng)和持續(xù)的壓力刺激下p53將加劇氧化壓力發(fā)揮促氧化作用。p53發(fā)揮抗氧化或是促氧化作用的機(jī)制主要是通過(guò)調(diào)控其下游氧化還原相關(guān)基因。CDKNIA, PIG3,PUMA, BAX,GPX1等一系列p53靶基因均可在一定壓力刺激下調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS水平。E3泛素連接酶復(fù)合物的骨架蛋白CUL4B在多種生物進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用,包括細(xì)胞周期,DNA復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄。CUL4B在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)并具有明顯的促癌作用。但其對(duì)細(xì)胞衰老的影響尚不清楚。強(qiáng)烈壓力刺激后衰老和凋亡是細(xì)胞的兩種重要命運(yùn)走向。而這種走向在不同的細(xì)胞中往往存在傾向性,例如宮頸癌細(xì)胞HeLa,人類腎上皮細(xì)胞HEK293等往往容易走向凋亡而人類成骨肉瘤細(xì)胞U20S和正常人類成纖維細(xì)胞NHF則更容易走向衰老。為了探討CUL4B在細(xì)胞衰老中發(fā)揮的作用,我們利用人類成骨肉瘤細(xì)胞U20S和正常人類成纖維細(xì)胞NHF進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明CUL4B在壓力誘導(dǎo)的早衰細(xì)胞中存在蛋白水平的顯著下調(diào)并且這種下調(diào)促進(jìn)壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老進(jìn)程。p53可調(diào)控細(xì)胞活性氧水平,而細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的改變同樣可影響p53的激活,提示細(xì)胞內(nèi)可能存在p53-ROS反饋環(huán)。較強(qiáng)或持續(xù)壓力刺激下p53發(fā)揮促氧化作用,p53激活后可通過(guò)影響CDKN1A, PIG3等一些促氧化基因上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高可通過(guò)激活A(yù)TM進(jìn)一步激活p53通路。此時(shí)細(xì)胞內(nèi)存在強(qiáng)大的p53-ROS正反饋環(huán),持續(xù)的信號(hào)反饋激活后最終引起壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老或細(xì)胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)在我們的研究體系中p53-ROS正反饋環(huán)調(diào)控壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老,而CUL4B正是通過(guò)抑制這一正反饋環(huán)的信號(hào)激活減緩了壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。我們發(fā)現(xiàn)氧化壓力刺激后CUL4B能促進(jìn)p53泛素化,進(jìn)而促進(jìn)了p53的蛋白降解過(guò)程。氧化壓力刺激后,CUL4B缺失將引起p53半衰期的延長(zhǎng)而CUL4B過(guò)表達(dá)則引起p53半衰期的縮短,并且我們?cè)贜HF細(xì)胞中檢測(cè)到CUL4B蛋白與p53蛋白的直接結(jié)合,進(jìn)一步的泛素化實(shí)驗(yàn)也顯示壓力刺激下CUL4B能促進(jìn)p53的泛素化。綜上所述,我們的結(jié)果表明壓力刺激后CUL4B蛋白表達(dá)量顯著下調(diào),這種下調(diào)抑制了p53的泛素化降解從而延長(zhǎng)了p53的半衰期,進(jìn)而造成了p53-ROS正反饋環(huán)的持續(xù)激活,最終抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老；CUL4B過(guò)表達(dá)后,經(jīng)壓力刺激時(shí)p53泛素化降解加快半衰期縮短,從而顯著抑制p53-ROS正反饋環(huán)的激活,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖減緩壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。我們的研究推進(jìn)了對(duì)p53在壓力誘導(dǎo)細(xì)胞衰老過(guò)程中的作用以及其上游調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。第一部分CUL4B在壓力誘導(dǎo)的早衰細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)Cullin家族是目前己知最大的一類E3泛素連接酶,其中CUL4B是該家族的重要成員。CUL4B在多種表觀修飾和生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。該基因在多種腫瘤組織中過(guò)表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性程度,而CUL4B低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞則表現(xiàn)為增殖減緩,細(xì)胞惡性程度降低。此外,CUL4B在表觀調(diào)控方面抑制了一些衰老相關(guān)基因的表達(dá),例如p16和CXCR2,由此我們推測(cè)CUL4B在細(xì)胞衰老過(guò)程中可能發(fā)揮作用。為此,我們首先檢測(cè)了CUL4B在多種類型衰老細(xì)胞中的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明CUL4B在壓力誘導(dǎo)的早衰細(xì)胞(電離輻射,H202或羥基脲誘導(dǎo)的早衰細(xì)胞)中蛋白表達(dá)水平下調(diào)而在端�？s短引起的復(fù)制衰老細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平不變。并且我們進(jìn)一步在小鼠耳朵成纖維細(xì)胞(MSF)中檢測(cè)了CUL4B的蛋白表達(dá)情況,結(jié)果表明這種經(jīng)受較強(qiáng)氧化壓力的小鼠細(xì)胞衰老后CUL4B的蛋白表達(dá)水平同樣顯著下調(diào)。值得一提的是壓力誘導(dǎo)早衰細(xì)胞中CUL4B蛋白水平的下調(diào)并沒(méi)有伴隨轉(zhuǎn)錄水平的改變,因此CUL4B的蛋白表達(dá)下調(diào)不是由于轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)引起的,這種蛋白水平的顯著下調(diào)可能是通過(guò)蛋白降解或microRNA的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。第二部分CUL4B抑制壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰伴隨細(xì)胞衰老會(huì)有一系列基因表達(dá)水平的改變,這些改變可能是衰老發(fā)生的一部分原因也可能是衰老發(fā)生后的一種結(jié)果。通過(guò)第一部分結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)壓力誘導(dǎo)細(xì)胞早衰后CUL4B蛋白水平顯著下調(diào),但我們并不清楚這種下調(diào)是細(xì)胞衰老的原因還是結(jié)果。為了解開這一疑惑,我們構(gòu)建了CUL4B低表達(dá)和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系,并利用這些細(xì)胞系進(jìn)行了一系列的壓力刺激后早衰情況的檢測(cè)。結(jié)果表明壓力刺激后CUL4B低表達(dá)細(xì)胞的衰老染色陽(yáng)性比例顯著升高而BrdU摻入比例顯著降低；與此相對(duì)應(yīng)的是CUL4B過(guò)表達(dá)細(xì)胞的衰老染色陽(yáng)性比例顯著降低而BrdU摻入比例顯著升高,即CUL4B低表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞早衰而CUL4B過(guò)表達(dá)則顯著減緩細(xì)胞早衰。與以上結(jié)果相對(duì)應(yīng)的是CUL4B在復(fù)制衰老中不存在蛋白水平的顯著下調(diào),其表達(dá)水平的改變也不會(huì)影響復(fù)制衰老。此外,Cul4b敲除小鼠的耳朵成纖維細(xì)胞相對(duì)于野生型小鼠的耳朵成纖維細(xì)胞在氧化壓力下更容易衰老。而CUL4B轉(zhuǎn)基因小鼠的耳朵成纖維細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞對(duì)細(xì)胞早衰有顯著的抵抗作用。并且CUL4B表達(dá)情況的改變不影響壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。綜上所述,CUL4B表達(dá)水平顯著影響壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老進(jìn)程。第三部分CUL4B對(duì)p53-ROS正反饋環(huán)的負(fù)調(diào)控抑癌基因p53是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子,壓力刺激后p53可被磷酸化激活,這種活性狀態(tài)的p53進(jìn)入細(xì)胞核并結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子處調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性。其下游靶基因中包含大量的抗氧化及促氧化相關(guān)基因。較為緩和的壓力刺激下,p53可通過(guò)下游抗氧化基因發(fā)揮抗氧化作用；而強(qiáng)烈壓力刺激下p53通常通過(guò)下游促氧化基因發(fā)揮促氧化作用。p53野生細(xì)胞受MDM2拮抗劑Nutlin-3處理后細(xì)胞ROS水平顯著升高,而p53缺失后這一升高現(xiàn)象被完全抑制。這一現(xiàn)象表明p53可通過(guò)調(diào)控這些氧化還原相關(guān)基因的表達(dá)而調(diào)控ROS的水平�；钚匝�(ROS)是細(xì)胞正常代謝的一種產(chǎn)物,細(xì)胞維持一定水平的ROS也是維持細(xì)胞增殖所必須的,但是過(guò)高水平的ROS會(huì)引起細(xì)胞強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)并使細(xì)胞走向衰老或凋亡。ROS可通過(guò)激活A(yù)TM而進(jìn)一步激活p53通路,因此細(xì)胞內(nèi)存在p53-ROS反饋環(huán)。強(qiáng)烈壓力刺激下,p53-ROS正反饋環(huán)會(huì)使信號(hào)持續(xù)激活從而促進(jìn)細(xì)胞衰老或凋亡。為了探究CUL4B抑制細(xì)胞早衰的調(diào)控機(jī)制,我們用雙氧水和Nutlin-3分別處理CUL4B低表達(dá)及過(guò)表達(dá)的細(xì)胞48小時(shí),之后對(duì)細(xì)胞的ROS水平及p53的激活水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示壓力刺激后CUL4B低表達(dá)細(xì)胞活性氧水平及p53激活情況顯著高于對(duì)照細(xì)胞；而CUL4B過(guò)表達(dá)細(xì)胞活性氧水平及p53激活情況均受到一定程度的抑制。我們由此推測(cè)CUL4B低表達(dá)強(qiáng)化了p53-ROS正反饋環(huán),而CUL4B過(guò)表達(dá)抑制了這一反饋環(huán)。我們進(jìn)一步證實(shí)CUL4B對(duì)細(xì)胞早衰的調(diào)控依賴于p53-ROS正反饋環(huán)�；钚匝跚宄齽㎞-乙酰基半胱氨酸(NAC)的拯救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CUL4B缺失促進(jìn)的早衰以及p53的過(guò)度激活依賴于細(xì)胞內(nèi)過(guò)量產(chǎn)生的ROS。而同時(shí)干擾CUL4B和p53后CUL4B低表達(dá)引起的過(guò)度早衰被完全逆轉(zhuǎn),這一拯救實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明CUL4B缺失對(duì)細(xì)胞早衰的促進(jìn)依賴于p53。綜上所述,CUL4B缺失后持續(xù)激活的p53-ROS正反饋環(huán)促進(jìn)了細(xì)胞早衰,而CUL4B過(guò)表達(dá)則通過(guò)抑制p53-ROS正反饋環(huán)減緩壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰。第四部分CUL4B促進(jìn)p53的泛素化及蛋白降解CUL4A與CUL4B存在大量的同源序列,因此在細(xì)胞功能上經(jīng)常發(fā)揮類似作用。已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)CUL4A可促進(jìn)p53的泛素化降解,所以接下來(lái)我們檢測(cè)了CUL4B對(duì)p53泛素化的影響。我們發(fā)現(xiàn)壓力刺激后CUL4B能促進(jìn)p53泛素化并促進(jìn)p53的蛋白降解。氧化壓力刺激后,CUL4B缺失引起p53半衰期的延長(zhǎng)而CUL4B過(guò)表達(dá)則引起p53半衰期的縮短,并且我們?cè)贜HF細(xì)胞中檢測(cè)到CUL4B蛋白與p53蛋白的直接結(jié)合,進(jìn)一步的泛素化水平檢測(cè)也驗(yàn)證了壓力刺激后CUL4B促進(jìn)p53的泛素化。這些結(jié)果表明CUL4B通過(guò)直接促進(jìn)p53泛素化而抑制p53-ROS正反饋環(huán)并最終減緩細(xì)胞早衰。
【關(guān)鍵詞】：衰老 p53 活性氧 CUL4B 泛素化
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2
【目錄】：

• 中文摘要8-13
• 英文摘要13-19
• 符號(hào)說(shuō)明19-21
• 前言21-24
• 第一部分 CUL4B在壓力誘導(dǎo)的早衰細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)24-52
• 材料與方法25-44
• 結(jié)果44-50
• 討論50-52
• 第二部分 CUL4B抑制壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰52-70
• 材料與方法53-58
• 結(jié)果58-68
• 討論68-70
• 第三部分 CUL4B對(duì)p53-ROS正反饋環(huán)的負(fù)調(diào)控70-89
• 材料與方法71-75
• 結(jié)果75-87
• 討論87-89
• 第四部分 CUL4B促進(jìn)p53的泛素化及蛋白降解89-103
• 材料與方法90-94
• 結(jié)果94-100
• 討論100-103
• 結(jié)論103-104
• 參考文獻(xiàn)104-111
• 致謝111-113
• 發(fā)表學(xué)位論文目錄113-114
• 綜述114-130
• 參考文獻(xiàn)122-130
• 英文論文1130-165
• 英文論文2165-177
• 附件177

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