研究背景:p53功能障礙是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因。p53基因突變是p53功能失活的主要方式,在所有癌癥病例中約有一半發(fā)生p53基因突變。在沒(méi)有發(fā)生p53基因突變的腫瘤細(xì)胞中,p53正調(diào)控因子的表達(dá)下調(diào)或/和負(fù)調(diào)控因子的過(guò)度激活也可以導(dǎo)致野生型p53功能失活。本研究室前期發(fā)現(xiàn)CCDC106可以促進(jìn)p53蛋白的降解,而ZCCHC10可以抑制p53蛋白的降解。本論文進(jìn)一步對(duì)CCDC106和ZCCHC10在癌癥組織中的表達(dá)及其對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展的作用進(jìn)行研究。研究方法:利用熒光定量PCR方法和Western blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量。采用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建基因過(guò)表達(dá)和干擾的穩(wěn)定細(xì)胞株。采用免疫共沉淀法和GST-pull down檢測(cè)蛋白相互作用。核質(zhì)分離和免疫熒光染色檢測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位。磷酸化抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)的磷酸化。MTT法測(cè)定細(xì)胞活力,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡,平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,TransWell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。采用皮下移植瘤小鼠模型研究CCDC106或ZCCHC10對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。采用尾靜脈注射小鼠模型研究Z...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 p53作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抑癌功能
        1.1.1 p53蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.1.2 p53調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡
        1.1.3 p53抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移
    1.2 p53基因突變是癌癥中最常見(jiàn)的突變
        1.2.1 p53突變的熱點(diǎn)和頻率
        1.2.2 突變對(duì)p53功能的影響
    1.3 MDM2介導(dǎo)p53泛素化是野生型p53失活的主要因素
        1.3.1 p53蛋白質(zhì)的泛素化主要被MDM2調(diào)控
        1.3.2 調(diào)控p53泛素化降解的其它E3連接酶
        1.3.3 調(diào)控p53去泛素化的相關(guān)途徑
        1.3.4 和p53泛素化降解有關(guān)的蛋白
    1.4 本論文的研究思路和研究意義
第二章 CCDC106在乳腺癌和宮頸癌中的作用及分子機(jī)制
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.2.1.1 細(xì)胞株和菌株
            2.2.1.2 載體和工具酶
            2.2.1.3 主要試劑與試劑盒
            2.2.1.4 抗體
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
            2.2.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.2.3 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
            2.2.2.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)
            2.2.2.5 慢病毒感染及穩(wěn)定細(xì)胞株篩選
            2.2.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)法
            2.2.2.7 細(xì)胞增殖測(cè)定(MTT實(shí)驗(yàn))
            2.2.2.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)
            2.2.2.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
            2.2.2.10 Trans Well法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力
            2.2.2.11 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)
            2.2.2.12 RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)
            2.2.2.13 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)
            2.2.2.14 免疫熒光染色
            2.2.2.15 原核融合蛋GST-p53的獲得
            2.2.2.16 細(xì)胞凋亡分析
            2.2.2.17 核質(zhì)分離
            2.2.2.18 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 干擾CCDC106 可穩(wěn)定p53,并抑制具有wtp53 的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲
        2.3.2 蛋白激酶CK2 磷酸化CCDC106
        2.3.3 CCDC106在S130和S147 位點(diǎn)的磷酸化是與p53 相互作用和CCDC106定位所必需的
        2.3.4 抑制CCDC106的磷酸化可減弱其對(duì)p53蛋白的降解
        2.3.5 抑制CCDC106 磷酸化可以抑制CCDC106 的促癌功能
        2.3.6 CCDC106 增加具有wtp53 的癌細(xì)胞對(duì)CX-4945 的耐藥性
    2.4 結(jié)論
第三章 ZCCHC10在肺癌中的作用及分子機(jī)制
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            3.2.1.1 細(xì)胞株和菌株
            3.2.1.2 肺癌臨床樣本
            3.2.1.3 化學(xué)試劑和抗體
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            3.2.2.1 生物信息學(xué)分析
            3.2.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
            3.2.2.3 慢病毒感染和穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建
            3.2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
            3.2.2.5 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.6 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)
            3.2.2.7 細(xì)胞計(jì)數(shù)法
            3.2.2.8 細(xì)胞增殖測(cè)定(MTT實(shí)驗(yàn))
            3.2.2.9 克隆形成實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.10 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.11 Trans Well法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力
            3.2.2.12 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.13 RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.14 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.15 免疫熒光染色
            3.2.2.16 細(xì)胞凋亡分析
            3.2.2.17 細(xì)胞周期分析
            3.2.2.18 裸鼠腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.20 組織切片制作以及蘇木精、伊紅染色
            3.2.2.21 免疫組化實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.22 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)
            3.2.2.23 泛素化分析
            3.2.2.24 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 ZCCHC10在LUAD中表達(dá)下調(diào)
        3.3.2 ZCCHC10 抑制含有wtp53 的肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲
        3.3.3 ZCCHC10在異種移植小鼠模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
        3.3.4 ZCCHC10 通過(guò)誘導(dǎo)p53 增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性
        3.3.5 ZCCHC10與p53 相互作用并穩(wěn)定p53
        3.3.6 ZCCHC10 通過(guò)阻斷MDM2與p53 的相互作用來(lái)抑制MDM2介導(dǎo)的p53泛素化
        3.3.7 ZCCHC10 通過(guò)促進(jìn)p53 的抑癌功能發(fā)揮作用
    3.4 討論
第四章 全文結(jié)論和研究展望
    4.1 全文結(jié)論
    4.2 研究展望
參考文獻(xiàn)
中英文縮寫表
攻讀學(xué)位期間科研成果
致謝



本文編號(hào)：3814726