本文關(guān)鍵詞：基于化痰法探討皂莢提取物對肝癌大鼠microRNA表達(dá)的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本課題前期研究發(fā)現(xiàn)中藥化痰藥皂莢具有明顯抗肝癌的作用,皂莢提取物能夠明顯調(diào)控肝癌細(xì)胞TGF-β/Smads信號系統(tǒng)以及PTEN/PI3K/AKT信號通路。我們推測皂莢提取物可能通過調(diào)節(jié)其相關(guān)micro RNAs表達(dá)來調(diào)控相關(guān)信號分子,從而發(fā)揮抗肝癌的作用。在前期研究的基礎(chǔ)上,我們通過理論和實驗研究,選擇與之相關(guān)的micro RNAs及靶基因進行驗證。進一步闡明該藥治療肝癌的分子機制,為中藥皂莢開發(fā)及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法:第一部分理論研究1.中醫(yī)藥防治肝癌的歷史悠久,在肝癌的病情進展中痰瘀互結(jié)貫穿于疾病始終,化痰法是治療肝癌的重要治法,也應(yīng)貫徹肝癌治療的始終。2.說明中藥化痰藥皂莢的價值、特點及古今臨床應(yīng)用。并闡述皂莢提取物具有抗肝癌作用的前期研究依據(jù)。3.隨著分子生物學(xué)對肝癌的研究進展,肝癌分子靶向治療是當(dāng)今臨床研究最為活躍的領(lǐng)域之一,在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下,結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),闡明中醫(yī)藥防治肝癌的機制,是中醫(yī)藥對肝癌防治的發(fā)展方向,也有助于發(fā)現(xiàn)肝癌治療的新靶點。第二部分實驗研究1.Walker-256移植性肝癌大鼠模型的建立取出儲存Walker-256癌細(xì)胞株的凍存管,立即放進37℃水浴槽中,等待完全融化過后,再將其取出,并于無菌的環(huán)境下進行細(xì)胞懸液吹打,然后轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到15ml離心管中。稍微晃動離心管,逐漸加入PBS緩沖液到8ml為止。然后以每分鐘1000轉(zhuǎn)的速度離心離心管10min,去除上清液,用PBS緩沖液沖洗2次。然后以4ml PBS緩沖液進行細(xì)胞重懸,將細(xì)胞懸液收入5ml注射器,再將其注入5只Wistar大鼠腹腔,每只注入1ml。每天觀察大鼠腹部膨隆情況,20天后形成癌性腹水。將上述Wistar大鼠腹腔內(nèi)的紅色洗肉水樣癌性腹水用注射器抽出15ml,放入離心機內(nèi)以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度離心2min,離心后去除上層清液體,保留下層粘稠的濃縮液體,用PBS緩沖液沖洗3次,制備細(xì)胞懸液備用,密度為2 x107/ml。將65只約200g左右的SD大鼠按體重平均分為6組,即空白組、模型組、皂莢提取物高劑量組,皂莢提取物中劑量組,皂莢提取物低劑量組及索拉非尼組,每組10只。另外5只作為驗證造模而備用。實驗手術(shù)前大鼠禁食12小時,將模型組、皂莢提取物高劑量組,皂莢提取物中劑量組,皂莢提取物低劑量組及索拉非尼組分別按40μg/100g體重水合氯醛腹腔內(nèi)麻醉,將大鼠以仰臥位固定在鼠板上,然后以0.5%活力碘腹部消毒,用手術(shù)剪沿腹白線剪開腹部皮膚,接著逐層分離,使大鼠腹腔暴露,即可以看到肝臟膨出。選擇最外層的肝葉,用注射器抽取1ml癌性腹水細(xì)胞懸液,以45度將注射器斜刺入所選肝葉內(nèi),深度約0.5cm,0.15ml細(xì)胞懸液緩緩?fù)扑妥⑸淦髯⑷胫苽涞陌┬愿顾?立即拔出注射器針頭,用消毒棉簽按壓穿刺點一直到不出血為止,將肝臟還納入腹腔內(nèi),常規(guī)縫合關(guān)閉腹腔,紅霉素軟膏擦拭消毒傷口。為證實造模成功,所有53只大鼠造模完畢后,在造模后第7天,在其中隨機挑選3只,另外12只正常大鼠中挑選2只,取出大鼠肝臟,觀察病理切片。2.處理措施根據(jù)人臨床用量(皂莢生藥量1.5g.70kg.d-1),給藥劑量根據(jù)參考文獻,人與大鼠體表面積折算的等效劑量計算為實驗灌胃劑量(折算系數(shù)如下表,人體平均體重標(biāo)準(zhǔn)為70kg,大鼠平均體重標(biāo)準(zhǔn)為200g),按1:2:4設(shè)置皂莢提取物低劑量組(128.57mg.kg.d-1)、中劑量組(257.14mg.kg.d-1)和高劑量組(514.28mg.kg.d-1);索拉非尼:68.57mg/kg/d(索拉非尼成人0.8g/d,按人與小鼠體表面積折算的等效劑量計算);空白組給予0.9%生理鹽水10 ml/kg/d;模型組:建立肝癌模型后,給藥同空白組;各組灌胃給藥量均為相同體積;移植后1周后開始治療;各組連用28d。終止治療時間為移植后35d。將需取材大鼠行頸推脫臼處死,在無菌條件下,消毒后進行開腹,空白組選取大鼠組織結(jié)構(gòu)完整的部分做肝臟標(biāo)本;經(jīng)過造模的大鼠,選取肝臟內(nèi)癌組織,如有肝癌結(jié)節(jié)者,盡量取最大的部分;將取出組織用濾紙吸干后留存,將待檢測組織分組處理,切成范圍為1cm×1cm,厚0.2cm的組織塊,連續(xù)切片,用甲醛乙醇混合液對其進行固定3小時,然后自動脫水固定,用于HE染色及Tunel細(xì)胞凋亡檢測大鼠肝臟病理切片的制作。3.實驗方法實驗一:觀察各組大鼠組織病理切片的形態(tài)學(xué)改變;用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)觀察各組組織中細(xì)胞凋亡情況,計算細(xì)胞凋亡率,進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗二:用Real-time PCR檢測技術(shù)檢測各組大鼠組織中mi R-21、mi R-181b、mi R-183的表達(dá)量,進行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗三:用Western-blot檢測法和Real-time PCR檢測法,檢測各組大鼠組織中,PTEN、TIMP3、MMP2、MMP9、PDCD4蛋白和m RNA的表達(dá)量,通過統(tǒng)計學(xué)處理,對比分析。結(jié)果:實驗一皂莢提取物對肝癌大鼠病理組織形態(tài)的影響1.從形態(tài)學(xué)角度觀察正常組中肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整,細(xì)胞胞漿胞核均勻,肝細(xì)胞索排列整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列。胞核較大,位于肝細(xì)胞中央,整個狀態(tài)均一。肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤,無纖維組織增生。而模型組中肝小葉失去正常結(jié)構(gòu),大部分肝小葉被腫瘤組織代替,周邊的肝小葉受壓質(zhì)地變實,肝竇擴張,肝血竇周圍可見纖維組織增生。匯管區(qū)明顯增寬,有大量的成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞呈圓形,再生活躍,異型性明顯,細(xì)胞核染色變深,核質(zhì)比變大,部分出現(xiàn)核固縮和核碎裂現(xiàn)象,腫瘤細(xì)胞呈團塊狀分布,有的部分出現(xiàn)凝固性壞死,染色呈深紅色。將皂莢提取物低劑量組的病理切片和模型組相比,雖然可見肝小葉失去正常結(jié)構(gòu),一部分肝小葉被腫瘤組織取代;但細(xì)胞形態(tài)有些許的改善,不過依然出現(xiàn)很嚴(yán)重的核固縮現(xiàn)象,核質(zhì)比很大,部分細(xì)胞呈團塊狀。肝竇擴張,肝血竇周圍有纖維組織增生。皂莢提取物中劑量組相對于模型組來看,有較大程度的改善,可明顯看出肝小葉的結(jié)構(gòu)有了一定的恢復(fù),腫瘤組織、異型性細(xì)胞數(shù)量和過塑細(xì)胞數(shù)量減少,核質(zhì)比較大的細(xì)胞數(shù)量也明顯減少。肝血竇周圍偶爾可見到纖維組織增生。皂莢提取物高劑量組中,從形態(tài)上看肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰完整,細(xì)胞胞漿胞核均勻,大部分肝小葉細(xì)胞正常,部分細(xì)胞有核固縮和異型性的現(xiàn)象,但是相較于模型組,狀態(tài)改善很明顯。肝血竇周圍很少見到纖維組織增生。索拉菲尼組的形態(tài)學(xué)較模型組改變最為明顯,并且最接近于正常組,肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰完整,細(xì)胞胞漿胞核均勻,肝細(xì)胞索排列整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列。胞核較大,位于肝細(xì)胞中央,整體分布較均一。肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤,基本沒有纖維組織增生。與正常組相比,有很少部分細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)異型性,無團狀分布現(xiàn)象。2.采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測技術(shù),觀察6組切片的細(xì)胞凋亡情況,每組取4個視野,顯微鏡下組織切片上凋亡的細(xì)胞為棕褐色,圖像分析系統(tǒng)定量分析肝癌細(xì)胞的凋亡指數(shù)。通過ANOVA檢測,P=0.000,P0.01,n=24,六組間比較有顯著性差異,各組間兩兩比較,皂莢提取物組與索拉非尼組比較,P=0.274,P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其余各組間均有顯著性差異(P=0.000,P0.01)。實驗二皂莢提取物對肝癌大鼠mi RNA的影響1.通過Real-time PCR檢測肝癌細(xì)胞中mi R-21的表達(dá)水平。通過單因素方差分析,6組mi R-21的表達(dá)量有顯著性差異(P=0.000,P0.01)。各組間兩兩比較,除皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.975,P0.05)。其余各組間均有顯著性差異(P0.01)。2.通過Real-time PCR檢測肝癌細(xì)胞中mi R-181b的表達(dá)水平。通過單因素方差分析,6組mi R-181b的表達(dá)量有顯著性差異(P=0.000,P0.01)。各組間兩兩比較,除皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.954,P0.05)。其余各組間均有顯著性差異(P0.01)。3.通過Real-time PCR檢測肝癌細(xì)胞中mi R-183的表達(dá)水平(見表4和圖7)。通過單因素方差分析,6組mi R-183的表達(dá)量有顯著性差異(P=0.000,P0.01)。各組間兩兩比較,除皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.023,P0.05)。其余各組間均有顯著性差異(P0.01)。實驗三皂莢提取物對肝癌大鼠PTEN、TIMP3、MMP2、MMP9、PDCD4 m RNA和蛋白的影響1.分別應(yīng)用QRT-PCR和Western blot檢測肝癌大鼠組織中PTEN m RNA和蛋白的表達(dá)水平,通過單因素方差分析,6組中PTEN m RNA和蛋白的表達(dá)水平均有顯著性差異(P=0.000,P0.01)。各組間PTENm RNA兩兩比較,皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.365,P0.05)。各組間PTEN蛋白兩兩比較,模型組和皂莢提取物低劑量組比較(P=0.011,P0.05),皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.076,P0.05),其余各組間均有顯著性差異(P0.01)。2.檢測肝癌大鼠組織中TIMP-3 m RNA和蛋白的表達(dá)水平,通過單因素方差分析,6組中TIMP-3 m RNA和蛋白的表達(dá)水平均有顯著性差異(P=0.000,P0.01)。各組間TIMP-3 m RNA兩兩比較,皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.064,P0.05)。各組間TIMP-3蛋白兩兩比較,皂莢提取物中劑量組和皂莢提取物低劑量組比較(P=0.017,P0.05),皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.054,P0.05),其余各組間均有顯著性差異(P0.01)。3.檢測肝癌大鼠組織中MMP2 m RNA和蛋白的表達(dá)水平,通過單因素方差分析,6組中MMP2 m RNA和蛋白的表達(dá)水平均有顯著性差異(P=0.000,P0.01)。各組間MMP2 m RNA兩兩比較,模型組和皂莢提取物低劑量組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.015,P0.05),皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.996,P0.05)。各組間MMP2蛋白兩兩比較,空白組與索拉非尼組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.04,P0.05),模型組和皂莢提取物低劑量組比較(P=0.036,P0.05),皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.129,P0.05),其余各組間均有顯著性差異(P0.01)。4.肝癌大鼠組織中MMP9 m RNA和蛋白的表達(dá)水平,通過單因素方差分析,6組中MMP9 m RNA和蛋白的表達(dá)水平均有顯著性差異(P=0.000,P0.01)。各組間MMP9 m RNA兩兩比較,模型組和皂莢提取物低劑量組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.032,P0.05),皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.859,P0.05)。各組間MMP9蛋白兩兩比較,空白組與索拉非尼組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.035,P0.05),模型組和皂莢提取物低劑量組比較(P=0.015,P0.05)、低劑量組和中劑量組比較(P=0.013,P0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.189,P0.05),其余各組間均有顯著性差異(P0.01)。5.檢測肝癌大鼠組織中PDCD4 m RNA和蛋白的表達(dá)水平,通過單因素方差分析,6組中PDCD4 m RNA和蛋白的表達(dá)水平均有顯著性差異(P=0.000,P0.01)。各組間PDCD4 m RNA兩兩比較,模型組和皂莢提取物低劑量組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.025,P0.05),其余各組間兩兩比較均有顯著性差異(P0.01)。各組間PDCD4蛋白兩兩比較均有顯著性差異(P0.01)。結(jié)論:1.皂莢提取物能夠誘導(dǎo)Walker-256移植性大鼠肝癌細(xì)胞凋亡,具有顯著的抗肝癌效應(yīng),其中以高劑量組效果最明顯,與索拉非尼無明顯差異。2.皂莢提取物在誘導(dǎo)大鼠肝癌細(xì)胞凋亡的過程中,可下調(diào)肝癌細(xì)胞中mi R-21,同時上調(diào)抑癌基因PTEN基因和蛋白的表達(dá);還能夠使mi R-181b下調(diào),同時影響TIMP3(基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3)/MMP2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)/MMP9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)系統(tǒng);還可以下調(diào)mi R-183,同時上調(diào)其靶目標(biāo)-抑癌基因PDCD4(程序性細(xì)胞凋亡因子4),其中以高劑量組的效果最顯著,與索拉非尼組沒有明顯差異。3.通過皂莢提起物能夠調(diào)控mi RNA及其相應(yīng)靶基因的表達(dá),進一步驗證了皂莢提取物促進肝癌細(xì)胞的凋亡的作用機理,也進一步驗證了皂莢提取物的多靶點抗癌效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：皂莢提取物 肝癌 microRNAs PTEN TIMP3/MMP2/MMP9 PDCD4 索拉非尼
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 中文摘要5-12
• Abstract12-22
• 英文縮略詞表22-23
• 前言23-25
• 第一部分 理論研究25-37
• 一、中國古代防治肝癌的歷史溯源25-29
• 1. 中醫(yī)對肝癌病名的認(rèn)識25-26
• 2. 中醫(yī)治療肝癌的歷史經(jīng)驗26-29
• 二、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對肝癌的認(rèn)識及研究進展29-33
• 1. 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對肝癌研究的歷史沿革29-32
• 2. 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對肝癌治療的研究進展32-33
• 3. 中醫(yī)藥治療肝癌的優(yōu)勢與方向33
• 三、從痰論治肝癌的理論基礎(chǔ)33-35
• 四、中藥化痰藥皂莢的研究35-37
• 第二部分 實驗研究37-89
• 實驗一 皂莢提取物對移植性肝癌大鼠抗癌效應(yīng)的實驗研究37-51
• 一、引言37-38
• 二、材料與方法38-44
• 1. 實驗材料38-40
• 2. 實驗方法40-44
• 三、結(jié)果44-49
• 四、小結(jié)49-51
• 實驗二 皂莢提取物對肝癌大鼠miRNA的影響51-66
• 一、引言51
• 二、材料與方法51-61
• 1. 實驗材料51-53
• 2. 實驗方法53-61
• 三、結(jié)果61-65
• 四、小結(jié)65-66
• 實驗三 皂莢提取物對肝癌大鼠PTEN、TIMP3、MMP2、MMP9、PDCD4 mRNA和蛋白的影響66-89
• 一、引言66
• 二、材料與方法66-79
• 1. 實驗材料66-69
• 2. 實驗方法69-79
• 三、結(jié)果79-87
• 四、小結(jié)87-89
• 討論89-94
• 1. 皂莢提取物在抗肝癌效應(yīng)中下調(diào)肝癌細(xì)胞中miR-21,上調(diào)PTEN的表達(dá)90-91
• 2. 皂莢提取物在抗肝癌效應(yīng)中下調(diào)肝癌細(xì)胞中miR-181b,調(diào)控TIMP-3/MMPs系統(tǒng)91-92
• 3. 皂莢提取物通過下調(diào)肝癌細(xì)胞中miR-183,上調(diào)PDCD92-94
• 結(jié)論94-95
• 參考文獻95-103
• 問題與展望103-104
• 綜述 肝癌分子生物學(xué)研究進展104-115
• 參考文獻110-115
• 附圖115-120
• 在讀博士期間,發(fā)表的論文和參與的課題120-121
• 致謝121

  本文關(guān)鍵詞：基于化痰法探討皂莢提取物對肝癌大鼠microRNA表達(dá)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：379275