巨自噬(以下統(tǒng)稱為自噬)是維持細胞內(nèi)動態(tài)平衡的一種基本生理過程,它通過降解一些錯誤折疊的蛋白質(zhì)以及衰老損傷的細胞器使得細胞能夠抵抗饑餓與藥物損傷等外界刺激。自噬與神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病以及腫瘤等諸多疾病密切相關(guān)。自噬體與溶酶體的融合是自噬通路中的一個重要環(huán)節(jié),自噬底物最終通過溶酶體內(nèi)的酸性水解酶進行降解,因此溶酶體的生成對于自噬過程至關(guān)重要。microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的小分子非編碼RNA,其長度約為22個核苷酸,能夠通過多種作用機制參與調(diào)控人體內(nèi)60%以上的基因。近年來,有諸多研究發(fā)現(xiàn)miRNA能夠通過靶向于不同的自噬溶酶體相關(guān)基因調(diào)節(jié)自噬過程,但是在這些研究中miRNA均是在細胞質(zhì)中通過經(jīng)典的分子機制發(fā)揮作用,對于細胞核中miRNA的作用幾乎沒有研究。本課題旨在探索miR-30b-5p與miR-148a-3p分別通過細胞核與細胞質(zhì)內(nèi)的不同作用方式調(diào)控溶酶體的生成與自噬過程,為闡述miRNAs新的作用機制以及治療自噬異常相關(guān)疾病提供了新的思路。1.細胞核中的miR-30b-5p抑制TFEB所介導(dǎo)的溶酶體生成及自噬:(1)miR-30b-5p可以與CLEAR元件直接結(jié)...

【文章頁數(shù)】：108 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 miRNA簡介
        1.1.1 miRNA的生成與經(jīng)典調(diào)控作用
        1.1.2 miRNA的亞細胞定位和入核機制
        1.1.3 miRNA在細胞核內(nèi)的作用
    1.2 .自噬簡介
        1.2.1 自噬概述
        1.2.2 自噬過程
    1.3 .轉(zhuǎn)錄因子TFEB
        1.3.1 TFEB的功能
        1.3.2 TFEB的核轉(zhuǎn)運過程
    1.4 .miRNA調(diào)節(jié)與自噬及疾病之間的關(guān)系
        1.4.1 miRNA對自噬的調(diào)節(jié)作用
        1.4.2 miRNA通過調(diào)節(jié)自噬治療疾病
    1.5 科學問題與研究意義
第2章 細胞核中的miR-30b-5p抑制TFEB所介導(dǎo)的溶酶體生成及自噬
    2.1 .前言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 細胞株
        2.2.2 實驗動物
        2.2.3 抗體
        2.2.4 試劑與試劑盒
        2.2.5 主要儀器與耗材
        2.2.6 引物
    2.3 實驗方法
        2.3.1 細胞培養(yǎng)
        2.3.2 細胞轉(zhuǎn)染
        2.3.3 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.4 蛋白質(zhì)印記法
        2.3.5 RNA提取,cDNA合成與熒光實時定量PCR
        2.3.6 MiRNA提取、反轉(zhuǎn)錄與熒光實時定量PCR
        2.3.7 熒光素酶檢測技術(shù)
        2.3.8 CRISPR/Cas9 基因敲除
        2.3.9 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)
        2.3.10 Pull down實驗
        2.3.11 細胞核與細胞質(zhì)分離提取RNA/蛋白
        2.3.12 免疫熒光實驗
        2.3.13 熒光原位雜交實驗
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 篩選與CLEAR元件相結(jié)合的候選miRNA
        2.4.2 miR-30b-5p能夠直接與CLEAR元件相結(jié)合
        2.4.3 miR-30b-5p通過CLEAR元件與溶酶體相關(guān)基因的啟動子區(qū)結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄
        2.4.4 細胞核中的miR-30b-5p能夠影響TFEB的轉(zhuǎn)錄活性
        2.4.5 miR-30b-5p不會與TFEB直接結(jié)合或者影響其入核
        2.4.6 miR-30b-5p抑制細胞中溶酶體的生成
        2.4.7 miR-30b-5p對于溶酶體生成的抑制作用是在細胞核中發(fā)生的
        2.4.8 miR-30b-5p抑制自噬體的生成以及自噬流的形成
        2.4.9 內(nèi)源性的miR-30b-5p抑制自噬溶酶體過程
        2.4.10 miR-30b-5p抑制自噬溶酶體過程是由TFEB所介導(dǎo)的
        2.4.11 小鼠肝臟中miR-30b-5p對于自噬溶酶體過程的調(diào)節(jié)
    2.5 小結(jié)與討論
第3章 miR-148a-3p通過直接與CTSA結(jié)合而抑制自噬
    3.1 前言
    3.2 實驗材料
    3.3 實驗方法
        3.3.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        3.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.3 考馬斯亮藍染色
        3.3.4 質(zhì)譜分析
        3.3.5 質(zhì)粒小量抽提
        3.3.6 質(zhì)粒中量抽提
        3.3.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        3.3.8 核酸膠回收
        3.3.9 PCR產(chǎn)物純化
        3.3.10 基因點突變
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 生物信息學及qPCR實驗發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p是 CTSA的負調(diào)控因子
        3.4.2 miR-148a-3p能夠抑制CTSA蛋白及mRNA的表達
        3.4.3 miR-148a-3p能夠抑制溶酶體生成以及自噬過程
        3.4.4 miR-148a-3p不影響TFEB的轉(zhuǎn)錄活性
        3.4.5 miR-148a-3p不會影響轉(zhuǎn)錄因子TFEB的表達
    3.5 小結(jié)與討論
第4章 結(jié)論與展望
    4.1 結(jié)論
    4.2 創(chuàng)新點
    4.3 展望
參考文獻
縮略詞表
致謝
作者簡歷及攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文與研究成果



本文編號：3785822