目的:前列腺組織主要由兩種類型上皮細胞組成,基底和管腔上皮細胞,兩者存在一定的相似性,同時又存在多種因素在兩者特異的表型方面參與調(diào)控及維持。本論文旨在:(1)研究前列腺基底上皮細胞特征是如何維持的?該過程需要哪些調(diào)控因子參與?(2)研究管腔上皮細胞特征是如何維持的?前列腺管腔上皮組織的三大屬性,細胞間連接、細胞極性和細胞分裂軸定位三者之間存在怎樣的相互作用?方法:通過開展一系列體內(nèi)體外實驗考察上皮間質(zhì)轉化(EMT)轉錄調(diào)控因子在前列腺上皮組織中的表達模式及生物學功能,利用高通量單細胞RNA測序分析及體內(nèi)實驗檢測Zeb1表達上皮細胞中富集哪些相關信號通路調(diào)節(jié)因子來維持基底上皮干細胞亞群的干性、EMT特征和基底細胞的正常發(fā)育。通過開展一系列體內(nèi)體外實驗考察細胞間連接蛋白E-cadherin在前列腺上皮組織中的表達模式和黏附連接缺陷小鼠的表型。通過轉錄組測序分析和生化實驗研究管腔上皮細胞特征維持的主要因素細胞間黏附連接蛋白E-cadherin,Scribble細胞極性蛋白復合物及LGN分裂紡錘體定位復合物三者之間的相互關系。所有的統(tǒng)計學檢驗均為雙側檢驗。結果:(1)上皮間質(zhì)轉化核心轉錄因子Z...

【文章頁數(shù)】：218 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞
緒論
    1.1 研究背景
    1.2 存在的科學問題
    1.3 研究技術路線
    1.4 科學意義
第一部分 前列腺基底干細胞維持基底上皮細胞特征和正常發(fā)育
    第一章 引言
        1.1 上皮組織概述
        1.2 基底上皮細胞特征維持中的EMT機制及分裂模式
        1.3 EMT特征維持的信號通路
    第二章 實驗材料與操作方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 實驗動物及人組織樣本
            2.1.2 實驗試劑
            2.1.3 實驗儀器耗材
        2.2 實驗操作方法
            2.2.1 小鼠基因型鑒定
            2.2.2 原代細胞獲得及細胞流式分選
            2.2.3 細胞甩片及免疫熒光染色
            2.2.4 冰凍切片及免疫熒光染色
            2.2.5 石蠟切片及其H&E染色
            2.2.6 質(zhì)粒抽提實驗
            2.2.7 病毒制備及目的細胞感染
            2.2.8 類器官培養(yǎng)及功能檢測
            2.2.9 泌尿生殖竇間質(zhì)細胞分離及培養(yǎng)
            2.2.10 原代前列腺上皮細胞分離及腎包膜移植實驗
            2.2.11 譜系示蹤實驗
            2.2.12 單細胞RNA測序和數(shù)據(jù)分析
            2.2.13 實時定量聚合酶鏈式反應
            2.2.14 蛋白免疫印跡
            2.2.15 統(tǒng)計學分析
    第三章 實驗結果
        3.1 發(fā)現(xiàn)EMT轉錄因子表達的前列腺上皮細胞
        3.2 高通量單細胞RNA-seq發(fā)現(xiàn)Zeb1⁺前列腺上皮細胞群
            3.2.1 獲得前列腺基底上皮單細胞
            3.2.2 獲得高質(zhì)量單細胞RNA測序數(shù)據(jù)
            3.2.3 單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)分析得到Zeb1⁺基底上皮細胞亞群
        3.3 Zeb1⁺上皮細胞與前列腺上皮組織之間的相關性研究
            3.3.1 成功構建Zeb1 熒光報告小鼠
            3.3.2 Zeb1 在前列腺上皮細胞中的分布及表達模式
        3.4 Zeb1⁺前列腺基底上皮細胞的生物學功能研究
            3.4.1 體外Zeb1⁺基底上皮細胞類器官形成實驗
            3.4.2 體內(nèi)Zeb1⁺基底上皮細胞腎包膜移植實驗
            3.4.3 體內(nèi)譜系示蹤Zeb1⁺基底上皮細胞多向分化的命運
            3.4.4 Zeb1 保證基底上皮細胞正常發(fā)育
        3.5 Wnt信號通路正向調(diào)控Zeb1⁺基底上皮細胞
            3.5.1 單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)顯示Zeb1⁺基底上皮細胞富集Wnt信號通路
            3.5.2 qRT-PCR實驗結果支持單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)分析結果
            3.5.3 APCmin模型小鼠中Zeb1⁺基底上皮細胞比例顯著增多
        3.6 研究模型圖及小結
    第四章 實驗結論、討論及展望
        4.1 實驗結論
        4.2 討論和展望
        4.3 科學意義
第二部分 細胞連接、細胞極性和細胞分裂軸定位共同維持前列腺管腔上皮細胞的組織特征
    第一章 引言
        1.1 上皮細胞極性的建立及維持
            1.1.1 上皮細胞極性組成-PAR complex
            1.1.2 上皮細胞極性組成-Scribble complex
            1.1.3 上皮細胞三種極性蛋白復合物之間的互作及應用
        1.2 上皮細胞間連接的建立及功能
        1.3 細胞分裂模式基礎知識
            1.3.1 細胞分裂模式相關分子調(diào)控機制
            1.3.2 細胞分裂模式研究的應用
    第二章 實驗材料與操作方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 實驗動物、細胞系、質(zhì)粒
            2.1.2 實驗試劑
            2.1.3 實驗儀器耗材
        2.2 實驗操作方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 石蠟切片及其免疫組織化學染色
            2.2.3 細胞增殖
            2.2.4 細胞實時示蹤實驗
            2.2.5 內(nèi)源性免疫共沉淀
            2.2.6 GST-pull down實驗
    第三章 實驗結果
        3.1 黏附連接蛋白集中表達及分布在成年小鼠前列腺管腔上皮細胞間
            3.1.1 qRT-PCR結果顯示黏附連接蛋白集中分布在前列腺管腔上皮細胞間
            3.1.2 免疫熒光染色結果表明黏附連接蛋白集中分布在前列腺管腔上皮細胞間
        3.2 黏附連接E-cadherin缺失促進前列腺管腔上皮細胞增殖能力及腫瘤發(fā)生發(fā)展
            3.2.1 體外E-cadherin表達下調(diào)促進前列腺上皮細胞增殖能力
            3.2.2 E-cadherin前列腺特異性敲除小鼠模型構建及表型探究
        3.3 黏附連接蛋白E-cadherin表達缺失導致細胞分裂軸定位異常
            3.3.1 體外黏附連接蛋白表達下調(diào)嚴重影響細胞分裂軸正確定位
            3.3.2 體內(nèi)黏附連接缺陷造成管腔上皮細胞分裂軸偏轉隨機化
            3.3.3 體外黏附連接蛋白表達下調(diào)顯著減弱蛋白LGN-NUMA的結合能力
            3.3.4 體內(nèi)黏附連接缺失導致LGN蛋白復合物細胞膜分布異常
        3.4 黏附連接蛋白E-cadherin丟失導致細胞極性蛋白復合物彌散分布
            3.4.1 體外敲低黏附連接蛋白表達水平顯著削弱蛋白DLG-SCRIB的結合能力
            3.4.2 體內(nèi)黏附連接缺失造成細胞極性蛋白復合物分布異常
        3.5 考察細胞連接、細胞極性和分裂軸定位三者間的互作及分子機制
            3.5.1 RNA-seq分析結果支持細胞連接、極性和分裂軸定位之間存在緊密互作
            3.5.2 增殖活躍的E-cadherin蛋白表達缺失的管腔上皮細胞更易發(fā)生腫瘤轉化
            3.5.3 E-cadherin/SCRIB/LGN三元復合物的形成維持前列腺管腔上皮組織結構
        3.6 研究模型圖及小結
    第四章 實驗結論、討論及展望
        4.1 實驗結論
        4.2 討論和展望
        4.3 科學意義
全文總結
    1.1 研究總結
    1.2 研究創(chuàng)新性
    1.3 科學意義
致謝
參考文獻
攻讀博士學位期間已發(fā)表或錄用的論文



本文編號：3783674