背景:在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,縫隙連接蛋白43(connexin,Cx43)為縫隙連接蛋白的主要的組成成分,Cx43可實現(xiàn)細胞與細胞之間的通訊(特別是神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞,星形膠質(zhì)細胞與少突膠質(zhì)細胞之間),并在離子傳遞、底物交換和傳遞信息方面起到重要的作用。而缺血性卒中發(fā)生后,縫隙連接功能異常,既能傳遞死亡信號和鈣超載,也能傳遞一些神經(jīng)保護因子,這一作用十分重要,然而機制尚不明確。近些年的研究表明,缺血后星形膠質(zhì)細胞細胞膜上Cx43的含量降低,并且內(nèi)化增加。此外亦有研究證實,在生理條件下內(nèi)化后的Cx43經(jīng)自噬選擇性降解。以上前期研究的結(jié)果為本研究提供了新的思路,即探究缺血后內(nèi)化的Cx43是否經(jīng)選擇性自噬降解及其詳細降解機制,以及干預(yù)Cx43自噬降解對神經(jīng)免疫和細胞凋亡的影響,這使得我們可以通過了解詳細的分子機制來尋找更多的治療干預(yù)靶點。目的:探討腦缺血后Cx43的去向,觀察Cx43是否通過細胞自噬途徑降解;明確腦缺血后Cx43自噬降解的分子機制;觀察促進Cx43自噬降解對腦缺血造成的神經(jīng)免疫和細胞凋亡的影響,從而判斷干預(yù)Cx43自噬降解能否能成為治療缺血性腦損傷的新靶點。方法:體外實驗采用原...

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
前言
中文摘要
Abstract
中英文縮略詞對照表
第1章 文獻綜述
    1.1 縫隙連接與縫隙連接蛋白 43
        1.1.1 Cx43及其構(gòu)成的縫隙連接與半通道的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.2 Cx43及其構(gòu)成的縫隙連接與半通道的合成、分布及調(diào)控機制
        1.1.3 Cx43及其構(gòu)成的縫隙連接、半通道與缺血性疾病
    1.2 細胞自噬
        1.2.1 自噬的分類
        1.2.2 自噬相關(guān)分子機制
        1.2.3 自噬的病理生理意義
    1.3 PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬
        1.3.1 PINK1和Parkin是線粒體質(zhì)量控制的關(guān)鍵組成部分
        1.3.2 Parkin的結(jié)構(gòu)和功能
        1.3.3 PINK1介導(dǎo)的Parkin募集和激活機制
        1.3.4 Parkin活化的下游事件和線粒體自噬的分子信號
    1.4 縫隙連接的降解途經(jīng)
        1.4.1 蛋白酶體途經(jīng)
        1.4.2 內(nèi)體/溶酶體途經(jīng)
        1.4.3 自噬/溶酶體途經(jīng)
    1.5 縫隙連接蛋白43與缺血后神經(jīng)炎癥和神經(jīng)凋亡的關(guān)系
    1.6 展望
第2章 實驗材料與方法技術(shù)
    2.1 實驗器材與試劑
        2.1.1 實驗器材
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 實驗所需試劑的配制
    2.2 統(tǒng)計學(xué)分析
    2.3 細胞培養(yǎng)
        2.3.1 C57BL6小鼠原代星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)
        2.3.2 Hela細胞系的培養(yǎng)
    2.4 實驗動物
    2.5 實驗技術(shù)
        2.5.1 細胞體外缺血模型的建立
        2.5.2 體內(nèi)缺血模型的建立
        2.5.3 細胞轉(zhuǎn)染(過表達)
        2.5.4 SiRNA轉(zhuǎn)染
        2.5.5 激光共聚焦顯微鏡觀察靶蛋白之間的共定位情況
        2.5.6 Western blotting檢測靶蛋白表達量的變化
        2.5.7 免疫共沉淀Co-IP檢測靶蛋白之間的連接情況
第3章 實驗結(jié)果
    3.1 缺血條件下Cx43經(jīng)自噬降解
        3.1.1 Cx43的含量在缺血后降低
        3.1.2 在Atg5 KD后,缺血后的Cx43含量出現(xiàn)了蓄積
        3.1.3 缺血后小鼠星形膠質(zhì)細胞的Cx43與自噬體膜蛋白LC3b的共定位程度增加
        3.1.4 在MCAO后,小鼠腦冰凍切片的Cx43與自噬體膜蛋白LC3b的共定位程度增加
    3.2 缺血后Cx43的自噬降解是通過OPTN和NDP52兩個自噬受體實現(xiàn)的
        3.2.1 缺血后小鼠星形膠質(zhì)細胞的Cx43與自噬受體OPTN的共定位程度增加
        3.2.2 缺血后小鼠星形膠質(zhì)細胞的Cx43與自噬受體NDP52的共定位程度增加
        3.2.3 在MCAO后,小鼠腦冰凍切片的Cx43與OPTN的共定位程度增加
        3.2.4 在MCAO后,小鼠腦冰凍切片的Cx43與NDP52的共定位程度增加
        3.2.5 在OPTN KD后,缺血后的Cx43含量出現(xiàn)了蓄積
        3.2.6 在NDP52 KD后,缺血后的Cx43含量出現(xiàn)了蓄積
        3.2.7 缺血后的小鼠星形膠質(zhì)細胞的Cx43與OPTN以及NDP52的連接增加
        3.2.8 缺血后的HeLa細胞的Cx43與過表達的OPTN以及NDP52的連接增加
        3.2.9 缺血后的HeLa細胞的Cx43與過表達的OPTN以及NDP52的共定位增加
    3.3 缺血條件下Cx43的自噬降解與PINK1相關(guān),且PINK1是自噬受體的上游蛋白
        3.3.1 在PINK1 KD后,缺血后的Cx43含量出現(xiàn)了蓄積
        3.3.2 在PINK1 KD后,缺血后的Cx43與OPTN以及NDP52的連接降低
        3.3.3 缺血后的HeLa細胞的Cx43與過表達的自噬受體以及PINK1三者的共定位增加
    3.4 Cx43缺血時的自噬降解與泛素化相關(guān),其結(jié)合泛素由p S65-Ub組成
        3.4.1 缺血后Cx43的總泛素修飾水平增加
        3.4.2 缺血后修飾Cx43的p S65-Ub水平升高
    3.5 缺血后Cx43的磷酸化伴隨其自噬降解的全過程,是其自噬降解的起點
        3.5.1 在Atg5 KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出現(xiàn)了蓄積
        3.5.2 在OPTN KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出現(xiàn)了蓄積
        3.5.3 在NDP52 KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出現(xiàn)了蓄積
        3.5.4 在PINK1 KD后,缺血后的磷酸化Cx43(S368)含量出現(xiàn)了蓄積
        3.5.5 缺血后的HeLa細胞的p Cx43(S368)與過表達的OPTN以及NDP52的連接增加
        3.5.6 缺血后磷酸化Cx43(S368)的總泛素修飾水平升高
        3.5.7 缺血后磷酸化Cx43(S368)的p S65-Ub水平升高
        3.5.8 缺血后,S368、Y265和Y247是和Cx43自噬降解的磷酸化位點
    3.6 抑制Cx43在缺血后的自噬降解促進了小鼠星形膠質(zhì)細胞從促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡谞顟B(tài)(基于TNF和IL-10 的檢測)
    3.7 敲低Cx43或加速其自噬降解可降低小鼠星形膠質(zhì)細胞缺血應(yīng)激下的細胞凋亡比率
    3.8 Atg5、OPTN、NDP52以及PINK1基因的敲低驗證
    3.9 過表達HA-Ub、RFP-NDP52以及RFP-OPTN的Hela細胞系所進行的免疫共沉淀實驗的Input組的western blotting
第4章 討論
第5章 結(jié)論
參考文獻
作者簡介及在學(xué)期間所獲得的科研成果
致謝



本文編號：3768782