本文關(guān)鍵詞：硫化氫通過(guò)miR-1-Bcl-2通路抑制缺血再灌注心肌細(xì)胞調(diào)亡的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR)損傷所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡,是影響缺血心肌組織恢復(fù)血液供應(yīng)后心臟功能恢復(fù)的重要因素之一。如何減少包括凋亡在內(nèi)的細(xì)胞死亡,保護(hù)心臟功能,目前仍然是心血管領(lǐng)域臨床相關(guān)科室主要研究的熱點(diǎn)之一。晚近研究發(fā)現(xiàn),新型氣體信號(hào)分子硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)對(duì)IR損傷心肌具有重要內(nèi)源性保護(hù)作用,它可以抑制細(xì)胞凋亡,發(fā)揮心肌保護(hù)作用,但具體機(jī)制不清。H2S可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)微小RNA (microRNA, miRNA, miR)的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡,還可以通過(guò)影響miR-133a的表達(dá),抑制心肌細(xì)胞肥大。研究證實(shí),miRNA參與調(diào)控了包括心肌細(xì)胞凋亡在內(nèi)的多種生理和病理過(guò)程。我們推測(cè),某些心肌特異性高表達(dá)的niRNA是否參與了H2S對(duì)心肌IR損傷的保護(hù),特別是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控某些重要凋亡相關(guān)靶基因的表達(dá),從而抑制心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡,保護(hù)心臟功能。第一部分H2S調(diào)節(jié)IR心肌細(xì)胞凋亡的在體實(shí)驗(yàn)研究一、研究目的評(píng)價(jià)H2S預(yù)處理對(duì)在體IR心肌的作用,并篩選H2S組與IR組之間表達(dá)差異顯著的miRNA.二、研究方法建立SD大鼠心肌IR損傷在體模型,并通過(guò)腹腔注射給予不同濃度(10、30、50、100 μM/kg) NaHS(H2S的供體)預(yù)處理。采用伊文氏藍(lán)和TTC雙染色法檢測(cè)大鼠心肌梗死面積,全自動(dòng)化學(xué)法檢測(cè)大鼠血清中LDH漏出量,TUNEL染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率,RT-PCR, Western blot法檢測(cè)抑凋亡關(guān)鍵基因Bcl-2的表達(dá)。采用miRNA芯片技術(shù),篩選出在IR組和NaHS處理組之間差異顯著的miRNA,并用RT-PCR法進(jìn)行驗(yàn)證。三、結(jié)果1、IR組心肌梗死面積明顯高于假手術(shù)組(Sham組),而給予NaHS預(yù)處理,可減小心肌梗死面積,且與濃度密切相關(guān),NaHS為30μM/kg時(shí)減小最為明顯。2、IR組的LDH漏出量較Sham組明顯上升,而給予NaHS預(yù)處理可以減少LDH漏出量,與濃度相關(guān),30 μM/kg時(shí)改善最為明顯。3、與Sham組相比,IR組心肌細(xì)胞凋亡率明顯增高,給予不同濃度NaHS預(yù)處理后,細(xì)胞凋亡率減少,且與濃度相關(guān),尤其以30μM/kg時(shí)減少最為明顯。4、與Sham組相比,IR組Bcl-2的mRNA、蛋白表達(dá)均顯著降低。NaHS處理各組Bcl-2的表達(dá)較IR組上調(diào),且與濃度相關(guān),尤其在30 μM/kg時(shí)其上調(diào)作用最為顯著。5、miRNA基因芯片篩選結(jié)果表明,NaHS組的miR-1表達(dá)較IR組顯著下調(diào)。四、結(jié)論1、H2S預(yù)處理對(duì)IR心肌具有明確的心肌保護(hù)作用,能抑制心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡,并且這種作用與濃度密切相關(guān),在30 μM/kg時(shí)保護(hù)作用最為顯著。2、H2S組與IR組表達(dá)差異顯著的miRNA包括miR-1,提示miR-1可能參與了H2S的心肌保護(hù)作用。第二部分MiR-1參與H2S影響心肌細(xì)胞凋亡的研究一、研究目的評(píng)價(jià)H2S預(yù)處理對(duì)離體缺氧復(fù)氧(HR)心肌細(xì)胞的作用,并探討miR-1是否參與H2S的影響心肌細(xì)胞凋亡的作用。二、研究方法建立原代心肌細(xì)胞HR損傷模型,并給予不同濃度(10、30、50、100 μM) NaHS預(yù)處理。采用MMT法檢測(cè)離體心肌細(xì)胞的活力,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH漏出量,流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率,RT-PCR、Western blot法檢測(cè)Bcl-2、miR-1的表達(dá)。將心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1模擬劑(mimic)上調(diào)miR-1的含量,再給予NaHS預(yù)處理、HR損傷,通過(guò)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率,明確miR-1是否參與H2S的抑凋亡作用。三、結(jié)果1、HR組細(xì)胞活力較對(duì)照組(Con組)明顯下降,而NaHS預(yù)處理各組細(xì)胞的活力較HR組明顯增高,且與濃度相關(guān),其中30μM組增加最為顯著。2、HR組細(xì)胞LDH漏出量較Con組明顯下降,而NaHS預(yù)處理各組細(xì)胞的LDH漏出量較HR組明顯增高,且與濃度相關(guān),其中30μM組改善最為顯著。3、HR組的細(xì)胞凋亡率明顯高于Con組,而NaHS預(yù)處理的細(xì)胞較HR組凋亡率有所下降,與濃度相關(guān),其中30μM組下降最為明顯。4、與Con組相比,HR組Bcl-2的mRNA、蛋白表達(dá)均顯著降低；而NaHS預(yù)處理各組的Bcl-2的表達(dá)量上調(diào),且與濃度相關(guān),在濃度為30μM時(shí)Bcl-2的上調(diào)最為明顯。5、同Con組相比,HR組miR-1表達(dá)量顯著升高；而NaHS預(yù)處理各組miR-1的表達(dá)量較HR組有所下降,與濃度相關(guān),在30μM時(shí),miR-1的下調(diào)最為顯著。6、心肌細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果表明：陰性對(duì)照(NC)組與NC+H2S組無(wú)顯著差異。與NC組相比,mimic組細(xì)胞凋亡率顯著增加；與HR+NC組相比,HR+mimic組細(xì)胞凋亡率增加顯著。提示上調(diào)miR-1的含量可增加心肌細(xì)胞凋亡。與HR+NC+H2S組相比,轉(zhuǎn)染mimic片段的]mimic組的細(xì)胞凋亡率明顯增加。表明同為接受HR處理,由于轉(zhuǎn)染mimic上調(diào)miR-1的含量,即使給予H2S預(yù)處理,也不能顯著減少心肌細(xì)胞凋亡率。四、結(jié)論1、在離體細(xì)胞水平,H2S具有明確心肌細(xì)胞保護(hù)作用,30μM濃度保護(hù)作用最為顯著。2、MiR-1參與了H2S抑制心肌細(xì)胞凋亡的過(guò)程,上調(diào)其表達(dá)可以削弱H2S的部分保護(hù)作用。第三部分H2S調(diào)控miR-1-Bcl-2影響心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究一、研究目的明確miR-1參與H2S心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。二、研究方法通過(guò)Γargetscan、miR-base等生物信息學(xué)網(wǎng)站計(jì)算、查詢和預(yù)測(cè),miR-1的潛在靶基因包括抑凋亡關(guān)鍵基因Bcl-2。將離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染不同濃度的miR-1模擬劑(mimic)和拮抗劑(AMO-1),通過(guò)檢測(cè)Bcl-2的蛋白表達(dá)水平,研究miR-1是否調(diào)控Bcl-2的表達(dá)。將心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Bcl-2干擾片段(siRNA),以下調(diào)Bcl-2的含量,再給予NaHS預(yù)處理、HR損傷,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,明確Bcl-2是否參與了H2S抑制心肌細(xì)胞凋亡作用。三、結(jié)果1、與NC組相比,mimic組Bcl-2的表達(dá)下降較明顯,且與濃度密切相關(guān),隨著mimic濃度的增加而Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減少。與之相反,AMO-1組miR-1的含量較NC組明顯降低；而Bcl-2的蛋白表達(dá)較NC組明顯上升,且呈濃度梯度變化,隨著AMO-1濃度的增加而增加。提示miR-1可以直接調(diào)控Bcl-2蛋白的表達(dá)。2、檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率,NC組與NC+H2S組比較無(wú)顯著差異。與NC組相比,siRNA組細(xì)胞凋亡率有所增加；與HR+NC組相比,HR+siRNA組細(xì)胞凋亡率增加更為明顯。提示轉(zhuǎn)染Bcl-2 siRNA干擾片段可增加心肌細(xì)胞凋亡。與HR+NC+H2S組相比,HR+siRNA+H2S組的細(xì)胞凋亡率明顯增加。提示轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)Bcl-2表達(dá)后,給予H2S減少心肌細(xì)胞凋亡的作用被顯著削弱。四、結(jié)論1、Bcl-2是miR-1的下游靶基因之一。2、Bcl-2參與了H2S抑制心肌細(xì)胞凋亡的過(guò)程,敲低其表達(dá)可以削弱H2S的部分保護(hù)作用。綜上所述,H2S抑制IR損傷心肌細(xì)胞凋亡的過(guò)程至少部分是通過(guò)miR-1-Bcl-2信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：硫化氫 microRNA-1 心肌細(xì)胞 凋亡 缺血再灌注損傷
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.2
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-15
• 縮略詞表15-17
• 前言17-20
• 研究背景17
• 實(shí)驗(yàn)假說(shuō)17-18
• 研究目的18
• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)18-20
• 第一部分 H_2S調(diào)節(jié)IR心肌細(xì)胞凋亡的在體實(shí)驗(yàn)研究20-52
• 材料與方法20-41
• 結(jié)果41-48
• 討論48-51
• 小結(jié)51-52
• 第二部分 MiR-1參與H_2S影響心肌細(xì)胞凋亡的研究52-78
• 材料與方法52-66
• 結(jié)果66-75
• 討論75-77
• 小結(jié)77-78
• 第三部分 H_2S調(diào)控miR-1—Bcl-2影響心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究78-91
• 材料與方法78-82
• 結(jié)果82-88
• 討論88-90
• 小結(jié)90-91
• 全文總結(jié)91-92
• 綜述92-98
• 參考文獻(xiàn)98-105
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文和參加科研工作105-108
• 致謝108-109

  本文關(guān)鍵詞：硫化氫通過(guò)miR-1-Bcl-2通路抑制缺血再灌注心肌細(xì)胞調(diào)亡的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：373447