發(fā)布時(shí)間：2017-05-17 02:02

  本文關(guān)鍵詞：糖尿病來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死的相關(guān)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)治療心肌梗死(MI)是MI治療可選擇的治療手段之一,MSC可以通過(guò)旁分泌機(jī)制分泌多種細(xì)胞因子,發(fā)揮其抑制凋亡、促進(jìn)血管新生、調(diào)節(jié)心室重塑、改善心臟功能的作用。與MSC移植治療MI的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不同,其臨床試驗(yàn)的效果并不確切。其原因可能是臨床患者常合并其他疾病,如糖尿病等。目前關(guān)于糖尿病人的MSC的生物學(xué)特性及其基因表達(dá)差異尚無(wú)報(bào)道。本研究的目的是比較糖尿病來(lái)源與非糖尿病來(lái)源的MSC在基因表達(dá)方面存在的差異,及其在治療心肌梗死方面的差異,發(fā)現(xiàn)可能引起這些差異的關(guān)鍵細(xì)胞因子(Bcl-2、Bcl-x L),并驗(yàn)證通過(guò)MSC修飾Bcl-x L是否可以增加MSC的存活率、改善心臟功能。方法:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Affymetrix全基因組基因芯片技術(shù)進(jìn)行MSC功能基因表達(dá)譜分析,以期發(fā)現(xiàn)冠心病合并糖尿病(CAD+DM)患者與冠心病非糖尿病(CAD)患者M(jìn)SC基因表達(dá)的差異。并通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染基因修飾MSC的方式研究h Bcl-x L在增加MSC在心肌梗死區(qū)域存活率、促進(jìn)血管新生、抑制凋亡、改善心臟功能等方面的作用。主要內(nèi)容包括三部分:1、冠狀動(dòng)脈旁路移植(CABG)術(shù)中獲取患者骨髓,體外擴(kuò)增MSC,收集第3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀篩選鑒定、繪制生長(zhǎng)曲線、提取RNA制作基因芯片、比較基因表達(dá)差異。2、CAD+DM與CAD患者M(jìn)SC移植到大鼠心肌梗死區(qū)域,觀察其對(duì)于心肌梗死的治療作用(抑制凋亡、改善心臟功能),以及Bcl-2、VEGF等表達(dá)情況。3、應(yīng)用慢病毒載體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染h Bcl-XL-IRES2-EGFP融合基因達(dá)到過(guò)表達(dá),同時(shí)單獨(dú)轉(zhuǎn)IRES2-EGFP作為對(duì)照。通過(guò)熒光顯微鏡、WB方法驗(yàn)證病毒轉(zhuǎn)染效率;流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定是否增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡的能力、ELISA測(cè)定MSC在低氧培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子變化,確定基因修飾后細(xì)胞分泌功能的變化。進(jìn)而進(jìn)行治療心肌梗死的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),觀察是否能夠提高M(jìn)SC在梗死區(qū)的存活率、抑制梗死區(qū)域的細(xì)胞凋亡、減少瘢痕形成、促進(jìn)血管新生、改善心臟功能。結(jié)果:1、糖尿病患者來(lái)源的MSC具有MSC的生物學(xué)特性:表達(dá)CD29、CD44;不表達(dá)CD34、CD45,體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其增殖能力顯著低于非糖尿病患者來(lái)源的MSC;2、Affymetrix基因芯片證實(shí):CAD+DM組與CAD組MSC相比較,功能蛋白表達(dá)基因中涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的基因有27個(gè),其中13個(gè)基因表達(dá)明顯上調(diào),分別為TNFRSF10B、TNFRSF21、NGF、CAV2、ITGA8、TNS1、ITGA2、AKT3、MBP、MAP2、INHBA、FST、PLA2G5;有14個(gè)基因表達(dá)明顯下調(diào)EPR1、BIRC5HELLS、BCL2、HGF、CASP1、SEPP1、ITGA9、MAP2K6RUNX3、TGFBR2、RUNX2、CTNNB1、CDC42。3、CAD+DM組與CAD組MSC細(xì)胞移植到大鼠心肌梗死邊緣區(qū)均能顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡、改善心臟收縮功能,但CAD+DM組這些作用與CAD組相比顯著降低,可能與CAD+DM組移植后Bcl-2表達(dá)顯著低于CAD組有關(guān)。4、慢病毒可以安全、有效的轉(zhuǎn)染h Bcl-x L-IRES-EGFP融合基因、IRES-EGFP融合基因到MSC內(nèi),EGFP的共轉(zhuǎn)染可以確定轉(zhuǎn)染效率并測(cè)定后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中MSC的存活率。研究顯示,病毒轉(zhuǎn)染未影響MSC的生物學(xué)特性,過(guò)表達(dá)h Bcl-x L可以增加MSC分泌細(xì)胞因子和抗凋亡能力,Western Blot檢測(cè)、Annexin V/PI檢測(cè)、ELISA檢測(cè)顯示,h Bcl-x L基因修飾的MSC表達(dá)h Bcl-x L顯著增加、抗凋亡能力增強(qiáng)、分泌VEGF、IGF-1、PDGF等細(xì)胞因子增加(p0.05)。5、h Bcl-x L基因修飾的MSC移植治療心肌梗死的在體實(shí)驗(yàn)提示:過(guò)表達(dá)h Bcl-x L的MSC在移植區(qū)域的存活率提高、可以顯著降低梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)毛細(xì)血管新生、減少瘢痕組織形成、改善心臟功能(p0.05)。結(jié)論:1、糖尿病來(lái)源的MSC在細(xì)胞增殖等方面與非糖尿病來(lái)源的MSC存在顯著差異,兩者存在基因表達(dá)差異,其Bcl-2表達(dá)顯著降低;2、糖尿病來(lái)源的MSC治療大鼠心肌梗死療效與非糖尿病來(lái)源的MSC相比顯著降低;3、應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染使MSC高表達(dá)Bcl-x L后可以顯著提高M(jìn)SC在低氧條件下的抗凋亡能力、顯著增加VEGF、IGF-1、PDGF等細(xì)胞因子的分泌。4、高表達(dá)Bcl-x L的MSC移植到心肌梗死區(qū)域可以顯著提高M(jìn)SC的存活率、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生、抑制瘢痕形成、改善心臟功能。
【關(guān)鍵詞】：冠心病 心肌梗死 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.22
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-24
• 一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的生物學(xué)特性及分離純化16-18
• 二、MSC 治療心肌梗死的研究現(xiàn)狀18-22
• 三、存在問(wèn)題和解決辦法22-23
• 四、MSC 治療心肌梗死展望23-24
• 第一部分 糖尿病與非糖尿病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因表達(dá)差異分析24-43
• 1 材料24-27
• 2 方法27-35
• 2.1 MSC的獲取、分離、培養(yǎng)27-28
• 2.2 MSC生長(zhǎng)曲線的繪制28
• 2.3 MSC的形態(tài)學(xué)和表型鑒定28
• 2.4 基因芯片檢測(cè)MSC基因表達(dá)28-34
• 2.5 基因表達(dá)差異在蛋白水平的驗(yàn)證34-35
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理35
• 3 結(jié)果35-41
• 3.1 MSC的培養(yǎng)和觀察35-37
• 3.2 MSC表面標(biāo)志物鑒定37
• 3.3 基因芯片待測(cè)RNA質(zhì)量控制情況37-38
• 3.4 基因表達(dá)譜差異情況38-40
• 3.5 差異基因表達(dá)在蛋白水平的驗(yàn)證40-41
• 4 討論41-43
• 第二部分 糖尿病與非糖尿病的冠心病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠心肌梗死療效比較43-54
• 1 材料43-44
• 2 方法44-48
• 2.1 病例資料與細(xì)胞培養(yǎng)44
• 2.2 大鼠心肌梗死模型的制作44-45
• 2.3 骨髓間充干細(xì)胞移植45
• 2.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)45
• 2.5 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)45-46
• 2.6 心肌組織蛋白印跡檢測(cè)46-47
• 2.7 免疫組化檢測(cè)47-48
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法48
• 3 結(jié)果48-51
• 3.1 大鼠心肌梗死模型的建立48-49
• 3.2 超聲心動(dòng)圖結(jié)果49-50
• 3.3 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)情況50
• 3.4 心肌組織蛋白表達(dá)情況50-51
• 4 討論51-54
• 第三部分 Bcl-x L基因修飾對(duì)MSC治療心肌梗死的療效影響54-80
• 1 材料55-57
• 2 方法57-65
• 2.1 慢病毒包裝57-59
• 2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)59-61
• 2.3 細(xì)胞成像61
• 2.4 免疫表型鑒定61
• 2.5 Annexin V/PI方法檢測(cè)低氧條件下MSC凋亡情況61-62
• 2.6 體外培養(yǎng)MSC分泌細(xì)胞因子的檢測(cè)62-63
• 2.7 心肌梗死模型建立和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植63
• 2.8 移植細(xì)胞存活率測(cè)定63-64
• 2.9 細(xì)胞移植后心肌細(xì)胞凋亡情況分析64
• 2.10 毛細(xì)血管密度測(cè)定64
• 2.11 瘢痕形成情況檢測(cè)64-65
• 2.12 MSC移植后心臟功能評(píng)估65
• 2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析65
• 3 結(jié)果65-77
• 3.1 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和人Bcl-x L在基因修飾的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)65-69
• 3.2 基因修飾的大鼠MSC的免疫表型特征69-70
• 3.3 Bcl-x L修飾抑制MSC的體外凋亡70-71
• 3.4 Bcl-x L修飾促進(jìn)MSC內(nèi)血管生成細(xì)胞因子的分泌71-72
• 3.5 Bcl-x L修飾促進(jìn)MSC在缺血心肌中的存活72-74
• 3.6 h Bcl-x L修飾的MSC可增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗凋亡能力74-75
• 3.7 Bcl-x L修飾的MSC促進(jìn)心肌梗死后的血管新生和預(yù)防瘢痕形成75
• 3.8 Bcl-x L修飾的MSC可促進(jìn)MI后心臟功能的恢復(fù)75-77
• 4 討論77-80
• 結(jié)論80-81
• 參考文獻(xiàn)81-97
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果97-98
• 致謝98

  本文關(guān)鍵詞：糖尿病來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死的相關(guān)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：372304