甲型肝炎病毒（hepatitis A virus,HAV）感染是誘發(fā)肝炎的主要原因之一,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起肝衰竭。目前,臨床上仍缺乏有效的直接抗病毒藥物。HAV在過去被認(rèn)為以無膜裸露病毒顆粒的形式存在,但最近的研究發(fā)現(xiàn)它通過劫持宿主細(xì)胞的內(nèi)體分選復(fù)合物（endosomal sorting complexes required for transport,ESCRT）而形成有膜包被的eHAV（enveloped-HAV）。與裸露病毒顆粒相比,eHAV特異存在一種病毒結(jié)構(gòu)蛋白pX。然而,HAV如何從宿主獲得膜的細(xì)節(jié)過程仍不清楚,pX在其中的功能尚無相關(guān)研究。首先,我們開發(fā)了一種名為Huh-7.5.1-GA的基于熒光實(shí)時(shí)報(bào)告HAV感染的檢測(cè)系統(tǒng)。該體系通過監(jiān)測(cè)綠色熒光蛋白（GFP）從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的現(xiàn)象可視化HAV感染,并且被驗(yàn)證可用于抗病毒藥物的篩選。例如,IFN-α可以有效阻止HAV持續(xù)感染的細(xì)胞中的GFP轉(zhuǎn)移。利用該報(bào)告體系,我們發(fā)現(xiàn)一種FDA批準(zhǔn)的用于治療慢性丙型肝炎的藥物sofosbuvir可有效抑制HAV感染。另一方面,我們發(fā)現(xiàn)病毒蛋白pX在eHAV形成過程中是必需的,且其N-末端... 

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 甲型肝炎病毒簡(jiǎn)介
        1.1.1 分子病毒學(xué)
        1.1.2 病毒生活史
            1.1.2.1 病毒入侵
            1.1.2.2 病毒蛋白翻譯
            1.1.2.3 病毒基因組RNA的合成
            1.1.2.4 病毒組裝和釋放
        1.1.3 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)體系
        1.1.4 病毒感染性的滴定
        1.1.5 流行病學(xué)
        1.1.6 天然免疫反應(yīng)與HAV感染
    1.2 細(xì)胞外囊泡以及與eHAV釋放的關(guān)系
        1.2.1 細(xì)胞外囊泡
        1.2.2 eHAV釋放與exosome的關(guān)系
    1.3 HAV結(jié)構(gòu)蛋白pX的特殊性
第2章 材料與方法
    2.1 質(zhì)粒與試劑
    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
    2.3 病毒的生產(chǎn)與感染
        2.3.1 慢病毒的包裝與生產(chǎn)
        2.3.2 HAV病毒的生產(chǎn)
    2.4 HAV感染的可視化檢測(cè)體系
    2.5 HAV感染性滴定
    2.6 shRNA介導(dǎo)的基因敲低
    2.7 密度梯度離心
    2.8 差速離心
    2.9 Western Blotting
    2.10 細(xì)胞總RNA抽提,反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR
    2.11 免疫熒光及活細(xì)胞熒光成像技術(shù)
    2.12 免疫電鏡和結(jié)構(gòu)電鏡
    2.13 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
    2.14 同源氨基酸序列以及NES的比對(duì)
    2.15 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第3章 第一部分研究?jī)?nèi)容
    3.1 HAV感染的可視化體系的建立和應(yīng)用
        3.1.1 熒光可視化體系的建立
        3.1.2 熒光可視化體系的應(yīng)用:篩選HAV的直接抗病毒藥物
第4章 第二部分研究?jī)?nèi)容
    4.1 pX引導(dǎo)融合蛋白eGFPpX進(jìn)入外泌體樣小泡中
        4.1.1 eGFPpX融合蛋白的構(gòu)建
        4.1.2 eGFPpX以EV形式釋放出細(xì)胞
        4.1.3 pX誘導(dǎo)eGFPpX進(jìn)入MVB
        4.1.4 pX與ALIX的相互作用
    4.2 pX對(duì)eHAV釋放的影響
        4.2.1 pX C-端的截短微弱的抑制總HAV感染性顆粒的釋放
        4.2.2 密度梯度分析pX的C-端的截短對(duì)eHAV釋放的影響
        4.2.3 HAV感染與外泌體釋放
        4.2.4 pX C-端一半與ALIX相互作用
    4.3 pX N-端的新型NES的發(fā)現(xiàn)
    4.4 NES功能的驗(yàn)證
第5章 討論
    5.1 用于HAV感染檢測(cè)的熒光報(bào)告體系
    5.2 HAV結(jié)構(gòu)蛋白pX與eHAV獲得膜的關(guān)系
參考文獻(xiàn)
附錄
    縮略語
致謝
作者簡(jiǎn)歷
專業(yè)綜述
    參考文獻(xiàn)


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Molecular evolution of hepatitis A virus in a human diploid cell line[J]. Cai-Hua Tang, Institute of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital, College of Medical Science, Zhejiang University, Hangzhou 310003, Zhejiang Province, China Cai-Hua Tang, Jiang-Sen Mao, Shao-Ai Chai, Yong Chen, Fang-Cheng Zhuang, Zhejiang Academy of Medical Science, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China.  World Journal of Gastroenterology. 2007(34)



本文編號(hào)：3657979