當(dāng)前位置：主頁 > 碩博論文 > 醫(yī)學(xué)博士論文 >

TPA誘導(dǎo)黑素干細(xì)胞參與表皮和毛囊再著色的分子機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間：2017-05-13 16:16

本文關(guān)鍵詞：TPA誘導(dǎo)黑素干細(xì)胞參與表皮和毛囊再著色的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景干細(xì)胞因其擁有自我更新、多向分化的特性,而成為組織再生和器官修復(fù)的重要細(xì)胞來源。毛囊呈周期性的生長、退化和休止,是研究干細(xì)胞生物特性的主要模型之一。有兩群干細(xì)胞—毛囊干細(xì)胞和黑素干細(xì)胞定居在毛囊隆突部(bulge)-次級毛芽部位。黑素干細(xì)胞又因?yàn)榫哂幸韵绿攸c(diǎn):黑素干細(xì)胞散在分布在毛囊干細(xì)胞間,以單細(xì)胞為單位行使其功能,分化后易于觀察,與其他干細(xì)胞所處的微環(huán)境相比最簡單,因而是一個(gè)很好的干細(xì)胞模型。在胚胎發(fā)育過程中,神經(jīng)脊產(chǎn)生的黑素母細(xì)胞隨發(fā)育遷入真皮,經(jīng)表皮遷移至新生毛囊內(nèi),定居在毛囊bulge后形成DCT(Tyrosinase)陽性的黑素干細(xì)胞,繼續(xù)向下遷移至毛母質(zhì),在此分化成成熟的黑素細(xì)胞,它們表達(dá)DCT、TYR、TRP1和MITF,催化黑素顆粒的形成。黑素干細(xì)胞伴隨著毛囊周期性的生長而活化。在生長期,DP(dermal papilla,毛乳頭)信號協(xié)同激活毛囊干細(xì)胞和黑素干細(xì)胞,促進(jìn)著色毛發(fā)的生長。在退化期,毛球部、內(nèi)根鞘和外根鞘細(xì)胞大量凋亡,只有少數(shù)細(xì)胞能回到干細(xì)胞巢,恢復(fù)靜息狀態(tài),等待DP信號的再次喚醒。黑素干細(xì)胞功能性缺失與毛發(fā)色素性缺失性疾病(如灰發(fā)癥)相關(guān)。因此,研究黑素干細(xì)胞的功能性再生對毛發(fā)色素性缺失性疾病的治療具有重要的科學(xué)意義。TGF-β(Transformation growth factor)、Wnt、Notch、NFIB等多條信號參與調(diào)控黑素干細(xì)胞。其中Wnt/β-catenin信號在黑素干細(xì)胞發(fā)育、啟動黑素干細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮著重要作用。阻斷Wnt1,Wnt3a或β-catenin的表達(dá)能抑制神經(jīng)脊產(chǎn)生黑素細(xì)胞;而過表達(dá)Wnt1或β-catenin顯著增強(qiáng)了黑素細(xì)胞的增殖和分化能力。研究還發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號能協(xié)同激活毛囊干細(xì)胞和黑素干細(xì)胞。著色毛發(fā)的再生依賴于毛囊內(nèi)的兩群干細(xì)胞的協(xié)同活化。最近已有研究不表明在小鼠背部皮膚中外源性的表達(dá)Wnt3a或者Wnt10b能誘導(dǎo)毛囊的黑素生成,然而如何有效的操控Wnt/β-catenin信號來協(xié)同活化這兩群干細(xì)胞同步參與著色毛發(fā)的再生值得進(jìn)一步研究?黑素細(xì)胞在鼠和人皮膚中的分布存在差異,只存在于成年小鼠的毛囊中,但在人的表皮、毛囊內(nèi)都能存活。而人表皮中的黑素細(xì)胞缺失或者功能性的缺失與色素缺失性疾病密切相關(guān),如白癜風(fēng)。研究發(fā)現(xiàn),利用紫外線(Ultra Violet,UV)照射白癜風(fēng)病人色素缺失區(qū)域后,在毛囊周圍可以觀測到色素斑;用中草藥處理白癜風(fēng)病變區(qū)域后,也能在的毛囊周圍觀測到色素斑。這就提示毛囊黑素干細(xì)胞可能參與了表皮的再著色。最近發(fā)現(xiàn)UV照射或者創(chuàng)傷能誘導(dǎo)黑素干細(xì)胞參與表皮的再次著色,但是黑素干細(xì)胞參與表皮的再著色過程中的具體細(xì)節(jié)以及分子機(jī)制的研究并不清楚。SCF、b FGF等信號是維持黑素細(xì)胞在表皮內(nèi)生存的重要信號。SCF/c-kit信號在黑素譜系細(xì)胞發(fā)育的過程中尤為關(guān)鍵。在黑素細(xì)胞的發(fā)育早期,SCF或c-kit受體功能性的缺失阻斷了黑素母細(xì)胞的遷移并促進(jìn)了黑素母細(xì)胞的凋亡;裸突變SCF或c-kit,或者在皮內(nèi)注射抗c-kit的中性抗體后導(dǎo)致毛發(fā)著色缺陷;體外實(shí)驗(yàn)證明SCF能顯著增加人黑素細(xì)胞的遷移和增殖。這些結(jié)果表明SCF/c-kit信號參與調(diào)控黑素細(xì)胞的遷移、生存和分化。而在K14陽性的角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)條件性的表達(dá)SCF后,黑素細(xì)胞能在表皮中生存,那么這些表皮內(nèi)的黑素細(xì)胞是發(fā)育早期從真皮遷移來的黑素細(xì)胞,還是受到SCF信號的刺激從毛囊遷移來的黑素干細(xì)胞?目前,并沒有研究表明SCF/c-kit信號能誘導(dǎo)黑素干細(xì)胞參與表皮著色。TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯),是一種使用最廣泛的佛波酯,最開始是從東南亞的灌木-巴豆中提取出的一種天然小分子。由于TPA與DAG(diacylglycerol,二酰甘油)的形態(tài)相似,目前常將TPA作為PKC(protein kinase C,蛋白激酶C)激活劑。TPA通過影響PKC、內(nèi)皮素、MAPK(mitogen-activated protein kinase)等信號來調(diào)控細(xì)胞增殖、分化。TPA可用于骨髓性白血病的治療以及人和鼠的原代黑素細(xì)胞培養(yǎng)。TPA能促進(jìn)神經(jīng)脊細(xì)胞向成熟黑素細(xì)胞分化、促進(jìn)黑素細(xì)胞的成熟并生產(chǎn)黑素顆粒。TPA能逆轉(zhuǎn)TGF-β信號對人黑素細(xì)胞的生長抑制,這是通過抑制該信號的關(guān)鍵因子—Smad的活性來實(shí)現(xiàn)的。此外,TPA還能活化毛囊干細(xì)胞進(jìn)而誘導(dǎo)毛囊的再生。然而,目前沒有有關(guān)TPA控制的信號在黑素干細(xì)胞增殖、分化、遷移等過程中發(fā)揮作用的相關(guān)報(bào)道,也沒有探究TPA是否能用于誘導(dǎo)黑素干細(xì)胞參與表皮黑素細(xì)胞或毛囊黑素細(xì)胞的再生的研究。位于bulge-次級毛芽的黑素干細(xì)胞與毛囊干細(xì)胞共享同一微環(huán)境,在毛囊生長早期,接受DP(dermal papilla,毛乳頭)信號的刺激后協(xié)同增殖、并沿著外根鞘向下遷移至毛母質(zhì)發(fā)生分化,最后形成著色毛發(fā)。在TPA或者創(chuàng)傷等特定環(huán)境的刺激下,毛囊干細(xì)胞向表皮遷移。此外,持續(xù)的TPA處理還能激活毛囊干細(xì)胞并誘導(dǎo)它們向下遷移,為再生的毛囊提供細(xì)胞來源。那么,TPA能否誘導(dǎo)黑素干細(xì)胞遷往表皮和毛囊?研究發(fā)現(xiàn)TPA能誘導(dǎo)鳥胚胎周圍神經(jīng)元表達(dá)c-kit,進(jìn)而促進(jìn)黑素細(xì)胞的形成。由于神經(jīng)元和黑素細(xì)胞都起源于神經(jīng)脊,而且SCF/c-kit信號在黑素細(xì)胞的增殖、遷移和分化過程中都發(fā)揮著重要作用,那么SCF/c-kit信號是否在TPA誘導(dǎo)的黑素干細(xì)胞遷往表皮參與表皮的再次著色過程中發(fā)揮著重要作用?此外,TPA在處理下丘腦神經(jīng)元和骨母細(xì)胞后能顯著的促進(jìn)β-catenin的表達(dá),有研究也發(fā)現(xiàn)TPA通過活化Wnt/β-catenin信號誘導(dǎo)毛囊的再生,那么TPA是否也能活化通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號協(xié)同活化黑素干細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞參與再生毛囊的著色?目的1.探討TPA能否活化毛囊bulge-次級毛芽處的黑素干細(xì)胞參與表皮再次著色、再生毛囊的著色,為臨床上治療皮膚和毛囊色素缺失性疾病提供新的重要參考依據(jù);2.探討TPA能否通過調(diào)控SCF/c-kit信號誘導(dǎo)黑素干細(xì)胞向表皮遷移并參與表皮的再次著色;3.探討TPA能否通過Wnt/β-catenin信號活化黑素干細(xì)胞,并誘導(dǎo)它們參與毛發(fā)著色。材料方法1.將TPA或者丙酮涂抹在7周大小的C57BL/6雌性小鼠背部皮膚上,利用HE、Masson Fontana染色檢測表皮的著色情況,利用L-DOPA法檢測催化TYR(黑素合成的關(guān)鍵酶)在皮膚內(nèi)的活性;利用免疫熒光檢測表皮和毛囊中DCT、TYR以及MITF的表達(dá);利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)標(biāo)記DCT與PCNA來檢測黑素干細(xì)胞和黑素祖細(xì)胞的增殖情況;利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)標(biāo)記DCT與MITF并結(jié)合皮膚的著色情況來分析TPA處理后黑素譜系細(xì)胞在毛囊和表皮中分布的差異情況。2.利用創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度的TPA對黑素母細(xì)胞系i MC23細(xì)胞遷移的影響;利用TPA處理的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞JB6 cl 30-7b,并用Transwell技術(shù)檢測處理過的JB6 cl 30-7b能否增強(qiáng)i MC23的遷移;用Na OH法檢測不同濃度的TPA對i MC23細(xì)胞黑素生成的影響,用L-DOPA法檢測TPA處理的i MC23細(xì)胞內(nèi)TYR活性的變化,并利用western blot和免疫熒光檢測控制黑素生成的關(guān)鍵酶—DCT、TRP1、TYR的表達(dá)。3.利用免疫熒光分別檢測SCF和c-kit在TPA或丙酮處理的小鼠背部皮膚中的表達(dá),利用q RT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)檢測TPA處理的皮膚以及JB6 cl 30-7b細(xì)胞中SCF m RNA的表達(dá),利用western blot檢測c-kit在TPA處理的i MC23細(xì)胞中的表達(dá);4.皮內(nèi)注射抗c-kit抗體(ACK2)阻斷SCF/c-kit信號后,利用HE染色、Masson Fontana染色檢測ACK2對TPA誘導(dǎo)的表皮著色的影響,利用L-DOPA法進(jìn)一步檢測處理后的皮膚內(nèi)TYR活性的變化,再利用免疫熒光檢測黑素細(xì)胞標(biāo)記物DCT、TYR、MITF的表達(dá);5.利用ACK2抑制SCF/c-kit信號后,采用Transwell技術(shù)檢測TPA處理的JB6 cl30-7b細(xì)胞對i MC23細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)能力是否會發(fā)生變化。6.將TPA或者丙酮涂抹在7周大小的C57BL/6雌性小鼠背部皮膚上誘導(dǎo)毛囊再生成,利用HE染色、Masson Fontana染色檢測TPA誘導(dǎo)的毛囊、丙酮處理的毛囊以及正常生長期VI期的毛囊之間著色的差異,利用免疫熒光技術(shù)檢測黑素細(xì)胞標(biāo)記物DCT、TRP1、TYR、MITF在各組之間的表達(dá)差異。7.用免疫熒光檢測各組毛囊中DCT和Brd U(5-bromo-2-deoxyuridine,5-溴脫氧尿嘧啶核苷)的共表達(dá),用來反映黑素干細(xì)胞、祖細(xì)胞的增殖情況;利用免疫熒光標(biāo)記MITF和Brd U,用于檢測黑素祖細(xì)胞在各組毛囊中的增殖情況。8.用免疫熒光檢測Wnt/β-catenin信號關(guān)鍵分子β-catenin在各組毛囊內(nèi)的黑素譜系細(xì)胞中的表達(dá)情況,旨在檢測Wnt/β-catenin信號在各組毛囊中的活化情況。9.在TPA處理的背部皮膚內(nèi)注射Dickkopf1(DKK1)或N1質(zhì)粒,利用免疫熒光檢測綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá),再用免疫熒光檢測核β-catenin在各組毛囊中的表達(dá)以驗(yàn)證DKK1對TPA活化的Wnt/β-catenin信號的抑制情況;利用HE染色和Masson Fontana染色對比DKK1+TPA處理的毛囊、N1+TPA處理的毛囊以及生長期VI期毛囊的著色情況;利用免疫熒光對比黑素細(xì)胞標(biāo)記物在各組毛囊中的表達(dá)情況。10.利用免疫熒光標(biāo)記DCT和Brd U、標(biāo)記MITF和Brd U在各組毛囊中的分布情況,反映DKK1對TPA活化的黑素干細(xì)胞、黑素祖細(xì)胞的影響。結(jié)果1.TPA處理顯著增加了表皮的厚度,處理2次后伴隨著皮膚內(nèi)TYR活性增加,表皮著色開始增加;免疫熒光的結(jié)果顯示在TPA處理2次后DCT、TYR和MITF表達(dá)在毛囊漏斗部和表皮中,而在TPA處理1次后DCT就在毛囊bulge-次級毛芽處增加;在TPA處理1次(包括2次、4次)后毛囊bulge-次級毛芽處的DCT陽性的黑素干細(xì)胞表達(dá)PCNA;不產(chǎn)黑素顆粒的DCT+MITF-的黑素干細(xì)胞出現(xiàn)在毛囊漏斗部而產(chǎn)黑素顆粒的成熟黑素細(xì)胞出現(xiàn)在表皮。這些結(jié)果說明黑素干細(xì)胞能直接遷出毛囊bulge-次級毛芽并在遷往表皮的過程中開始分化、生產(chǎn)黑素顆粒。2.TPA能顯著的增強(qiáng)i MC23細(xì)胞的遷移;TPA處理的JB6 cl30-7b細(xì)胞也能顯著的增加i MC23細(xì)胞的遷移;TPA以濃度依賴性促進(jìn)i MC23細(xì)胞內(nèi)黑素顆粒的生成,以濃度依賴性和時(shí)間依賴性增強(qiáng)i MC23細(xì)胞內(nèi)TYR活性;TPA處理顯著的增加了i MC23細(xì)胞內(nèi)DCT、TRP1和TYR的表達(dá)。3.TPA處理1次顯著促進(jìn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)SCF,但是沒有誘導(dǎo)c-kit的表達(dá),在TPA處理2次后c-kit才在表皮和毛囊漏斗部表達(dá);TPA處理能顯著增加皮膚中SCF m RNA的表達(dá)以及JB6 cl 30-7b細(xì)胞中SCF m RNA的表達(dá);TPA處理i MC23細(xì)胞3 h后c-kit的表達(dá)顯著增加。4.ACK2處理后,TPA誘導(dǎo)的表皮再次著色以及TPA增加的TYR活性都被顯著抑制,但TPA增加的表皮厚度沒有受到影響;同時(shí),DCT、TYR和MITF在TPA處理的毛囊漏斗部和表皮內(nèi)的表達(dá)被顯著抑制。這些結(jié)果提示,抑制SCF/c-kit信號阻止了毛囊黑素細(xì)胞向表皮遷移、減少了表皮的再次著色。5.Transwell結(jié)果顯示,ACK2處理后TPA誘導(dǎo)i MC23細(xì)胞遷移的作用被抑制,經(jīng)TPA處理的JB6 cl 30-7b細(xì)胞對i MC23細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)能力也被顯著抑制,該結(jié)果驗(yàn)證了角質(zhì)形成細(xì)胞來源的SCF/c-kit信號能顯著誘導(dǎo)黑素母細(xì)胞的遷移。6.TPA處理小鼠背部皮膚4周后能顯著的誘導(dǎo)分化正常的毛囊再生,該毛囊的毛干、毛球部尺寸較正常生長期VI期毛囊的更大,毛母質(zhì)的著色更明顯,毛球部內(nèi)表達(dá)DCT、TRP1、TYR和MITF更多。7.DCT和Brd U雙陽性細(xì)胞在TPA處理的毛囊bulge、毛母質(zhì)處顯著增加,MITF和Brd U雙陽性細(xì)胞在TPA處理的毛球部顯著增加,提示TPA顯著促進(jìn)了毛囊內(nèi)黑素干細(xì)胞、黑素祖細(xì)胞的增殖。8.在TPA處理的毛囊內(nèi)表達(dá)核β-catenin的黑素細(xì)胞數(shù)明顯增加,提示TPA顯著增加了Wnt/β-catenin信號在黑素細(xì)胞內(nèi)的活性。9.在TPA處理并注射質(zhì)粒的皮膚內(nèi),GFP明顯表達(dá)在毛囊、真皮和皮下組織中;DKK1顯著的抑制了TPA誘導(dǎo)的表達(dá)核β-catenin的黑素細(xì)胞數(shù),表明DKK1轉(zhuǎn)染成功后抑制了TPA誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號。此外,DKK1控制了TPA對毛球部、毛干大小、毛母質(zhì)著色的作用,抑制了DCT、TRP1、TYR和MITF在TPA處理的毛球部的表達(dá),表明抑制Wnt/β-catenin信號后毛球部、毛干大小以及毛母質(zhì)著色恢復(fù)到相對正常的水平。10.免疫熒光顯示DKK1顯著抑制了TPA增加的bulge和毛球部中DCT和Brd U雙陽性細(xì)胞數(shù)目,以及毛球部的MITF和Brd U雙陽性細(xì)胞數(shù)目,提示抑制Wnt/β-catenin信號能顯著抑制TPA促進(jìn)黑素干細(xì)胞和黑素祖細(xì)胞增殖的作用。結(jié)論1.TPA促進(jìn)黑素干細(xì)胞增殖、直接遷出干細(xì)胞巢、前往表皮參與表皮的再次著色,SCF/c-kit信號是TPA誘導(dǎo)的黑素干細(xì)胞遷移至表皮并參與其再次著色所必須的信號,這為臨床上治療皮膚色素性缺失性疾病提供重要的實(shí)驗(yàn)參考依據(jù);2.持續(xù)的TPA處理能活化黑素干細(xì)胞參與再生毛囊的著色,Wnt/β-catenin是調(diào)控TPA誘導(dǎo)的毛囊著色的關(guān)鍵信號,這為臨床上治療毛發(fā)色素缺失性疾病提供重要的理論參考。
【關(guān)鍵詞】：毛囊 黑素干細(xì)胞 Wnt/β-catenin信號 表皮 SCF/c-kit信號 TPA 黑素生成 DKK1
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R751
【目錄】：