發(fā)布時間：2022-02-10 17:32

　　研究背景惡性腫瘤一直是威脅人類健康的重要原因之一。隨著檢測方法的日益改進(jìn),癌癥早期診斷率逐漸增加。同時,隨著治療手段的提升和藥品研發(fā)的飛速發(fā)展,女性惡性腫瘤患者的生存期逐漸延長,使得化療對卵巢功能所造成的影響日益顯現(xiàn)出來。卵泡儲備對化療十分敏感,化療后短期可造成卵巢功能受損,長期可致生育率降低,早絕經(jīng)風(fēng)險明顯增加,如潮熱、失眠、骨鈣流失等,這些嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,為此與卵巢功能保護(hù)相關(guān)的研究越來越多�，F(xiàn)有的卵巢保護(hù)措施包括:卵巢組織凍存、胚胎或卵母細(xì)胞凍存、促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）以及干細(xì)胞治療等。其中,干細(xì)胞治療被認(rèn)為是目前最有前景的治療方法。干細(xì)胞能夠不斷進(jìn)行自我更新,并且具有多向分化潛能。生理情況下能夠替代衰老和凋亡的細(xì)胞,保證了機(jī)體組織結(jié)構(gòu)的完整以及正常生理功能的發(fā)揮。病理情況下,能夠抑制炎癥反應(yīng),促進(jìn)組織修復(fù),有助于受損組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。然而,干細(xì)胞治療也存在一定潛在風(fēng)險,例如,移植的細(xì)胞可能會引起血管栓塞、遺傳物質(zhì)發(fā)生突變、或造成機(jī)體腫瘤的發(fā)生,同時,干細(xì)胞的應(yīng)用還存在倫理上的爭議等。隨著干細(xì)胞旁分泌物質(zhì)外泌體的發(fā)現(xiàn),人們逐漸將研究重心轉(zhuǎn)向了干細(xì)胞分... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

外泌體的生物發(fā)生與作用途徑：早期的內(nèi)體是由內(nèi)膜內(nèi)陷形成的

215.次日將混合液取出，切勿震蕩或攪動混合液，1500×g離心30min。6.仔細(xì)將上清液去除干凈，勿使沉淀再次溶解。向沉淀中加入100ulPBS重懸，-80℃保存。7.圖2.1可見以上三種實(shí)驗(yàn)方法流程圖。2.3.6.5透射電子顯微鏡hAFSc-EXO形態(tài)由三種不同提取方法得到的外泌體樣品中分別取10ul滴在銅網(wǎng)上，室溫靜置1min。在銅網(wǎng)上滴加20ml/L磷鎢酸溶液約10μL，室溫負(fù)染1min。用濾紙將磷鎢酸溶液吸干，銅網(wǎng)放置于白熾燈下烤10min，于透射電鏡下觀察三種分離方法所獲得的外泌體情況并采集圖像。圖2.1常規(guī)超速離心法、濃縮后超速離心法以及SBI外泌體提取試劑分離提取hAFSc-EXO的流程示意圖2.3.7hAFSc-EXO的鑒定2.3.7.1用BCA法定量外泌體蛋白濃度1.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備：用BCA試劑盒內(nèi)的蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液和BSA粉末配制成濃度為25mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃保存。取適量25mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用PBS稀釋至濃度為0.5mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，分裝后于-20℃保存。2.BCA工作液的配制：根據(jù)待測樣品的數(shù)量，按50：1（BCA試劑A：BCA試劑B）的比例配置適量工作液，充分混勻，室溫待用。BCA工作液室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。3.蛋白濃度的測定：向96孔板內(nèi)分別加入0、1、2、4、8、12、16、20μL電白標(biāo)準(zhǔn)品，并用PBS定容到20μL。選取由常規(guī)超速離心法獲得的外泌體懸液作為待

23圖2.2hAFSc細(xì)胞形態(tài)（光學(xué)顯微鏡，100×）注：A：為首次換液后的成纖維樣細(xì)胞集落；B：為首次換液后的上皮樣細(xì)胞集落；C：為P3代hAFSc。2.4.2hAFSc表面蛋白標(biāo)志物的表達(dá)情況應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對P3代hAFS表面分子標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過分離培養(yǎng)獲得的hAFSc能夠表達(dá)干細(xì)胞特有的蛋白分子標(biāo)志物CD29和CD90，并表達(dá)多能干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物SSEA和Oct3/4。表達(dá)MHC（主要組織相容性復(fù)合體）I類分子蛋白HLA-ABC，不表達(dá)MHCII類分子蛋白HLA-DR。不表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD34（也是造血干細(xì)胞抗原）和白細(xì)胞共同抗原CD45，兩者與造血干細(xì)胞相關(guān)，是其表面的分子標(biāo)志物（圖2.3）。這些結(jié)果表明分離獲得的hAFSc具有多能干細(xì)胞特性，不含有造血干細(xì)胞成分，且不存在MHCII類分子蛋白，免疫原性較低，輸入機(jī)體內(nèi)不易誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，以上結(jié)果與以往研究相同，說明我們分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞為hAFSc。ABC

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Mesenchymal stem cell-derived exosomes promote neurogenesis and cognitive function recovery in a mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Edwin E.Reza-Zaldivar,Mercedes A.Hernández-Sapiéns,Yanet K.Gutiérrez-Mercado,Sergio Sandoval-ávila,Ulises Gomez-Pinedo,Ana L.Márquez-Aguirre,Estefanía Vázquez-Méndez,Eduardo Padilla-Camberos,Alejandro A.Canales-Aguirre.  Neural Regeneration Research. 2019(09)



本文編號：3619244