目的:宮頸癌（cervicalcancer）是婦科最常見的惡性腫瘤之一,已經(jīng)嚴(yán)重威脅到全球女性的健康。目前,使用順鉑結(jié)合放療的治療方案已經(jīng)作為治療宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)方案,尤其是對(duì)于局部晚期宮頸癌患者。然而,最初接受順鉑治療的患者在隨后的治療中往往會(huì)產(chǎn)生耐藥性。順鉑潛在的腎毒性、耳毒性和高催吐作用也限制了其在特殊人群中的使用。DNA分枝結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶-1（Flapendonuclease1,FEN1）是一種同時(shí)包含5’分枝狀結(jié)構(gòu)內(nèi)切酶活性（Flapendonuclease,FEN）、缺口依賴性5’內(nèi)切酶活性（Gapdependentendonuclease,GEN）及5’外切酶活性（Exonuclease,EXO）的核酸酶,在DNA復(fù)制中后隨鏈岡崎片段的成熟過程中及DNA損傷修復(fù)過程中起著至關(guān)重要的作用。FEN1過表達(dá)已在多種癌癥中被發(fā)現(xiàn),并且已經(jīng)證明FEN1抑制劑可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物（使DNA損傷相關(guān)的藥物）的敏感性。然而,FEN1缺陷或活性抑制是否會(huì)對(duì)宮頸癌細(xì)胞的放療起到增敏效應(yīng)尚不清楚。另外,由于FEN1在DNA代謝過程中的起著舉足輕重的作用,FEN1完全敲除小鼠模型胚胎致死。因... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：111 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

FEN1在宮頸癌中過表達(dá)，并且通過電離輻射可以進(jìn)一步誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)

結(jié)構(gòu)特異性核酸酶FEN1在宮頸癌治療中的作用及其機(jī)制研究第一部分23圖2FEN1抑制劑SC13增強(qiáng)Hela細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性A.用SC13（100μM）、電離輻射（5Gy）單獨(dú)或聯(lián)合處理Hela細(xì)胞，72小時(shí)后用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞數(shù)。B.使用不同劑量的電離輻射分別處理對(duì)照組和SC13（100μM）處理組的Hela細(xì)胞，觀察細(xì)胞活力。C.用SC13（100μM）、IR（5Gy）單獨(dú)或聯(lián)合處理Hela細(xì)胞，14天后觀察細(xì)胞集落的形成能力。D.為C圖的定量分析。同時(shí)我們還通過克隆形成試驗(yàn)進(jìn)一步證明了這一假設(shè)，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)EN1抑制劑SC13可以增強(qiáng)Hela癌細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性（p<0.05）（圖2C，2D），使用FEN1抑制劑SC13聯(lián)合電離輻射處理Hela細(xì)胞，可以明顯抑制Hela細(xì)胞克隆形成。為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，我們還嘗試構(gòu)建了針對(duì)FEN1基因的CRISPR-Cas9敲除質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，并加puromycin藥進(jìn)行篩選，然而，經(jīng)過幾次實(shí)驗(yàn)均未獲得FEN1基因敲除的Hela細(xì)胞株。推測原因可能是因?yàn)镕EN1在Hela細(xì)胞中功能互補(bǔ)的基因已經(jīng)因突變等變異失去了活性，無法替代FEN1在DNA

第一部分結(jié)構(gòu)特異性核酸酶FEN1在宮頸癌治療中的作用及其機(jī)制研究24復(fù)制中的功能。于是我們選擇了基因突變較少、基因背景較清晰的人源胚腎正常細(xì)胞株293T。針對(duì)293T進(jìn)行了FEN1基因敲除細(xì)胞系篩選，并通過Westernblot檢測驗(yàn)證了FEN1確實(shí)在很大程度上表達(dá)下調(diào)，但未完全敲除（圖3A，3B）。后續(xù)我們利用FEN1敲低細(xì)胞進(jìn)行了集落形成試驗(yàn)并用電離輻射處理。結(jié)果顯示，隨著電離輻射劑量的增加，293T細(xì)胞的克隆形成越來越少，并且FEN1敲低的293T細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞克隆形成減少更明顯。這表明FEN1敲低的細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞對(duì)電離輻射治療更為敏感（p<0.05）（圖3C，3D）。圖3FEN1敲低可以增強(qiáng)293T細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性A.針對(duì)FEN1基因的gRNA序列。B.Westernblot檢測293T細(xì)胞中FEN1基因敲除效率。C/D.對(duì)照組和FEN1基因敲除組經(jīng)電離輻射處理后293T細(xì)胞集落的形成情況展示。3FEN1抑制劑可促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡放療會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞基因組不穩(wěn)定和凋亡。為了確定FEN1抑制劑SC13是否對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，我們進(jìn)行了Hela細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。使用Annexin


本文編號(hào)：3604935