本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌二元信號(hào)系統(tǒng)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：金黃色葡萄球菌作為全球范圍內(nèi)的院內(nèi)及社區(qū)感染性疾病發(fā)生的主要誘因之一,能夠在許多部位引發(fā)感染,最常見的感染癥狀包括蜂窩組織炎、膿皰病及軟組織膿腫等。金黃色葡萄球菌作為一種成功的致病菌很大程度上歸因于其產(chǎn)生的多種致病因子,如溶血素、蛋白酶類、毒素及免疫調(diào)理素等。本論文對(duì)金黃色葡萄球菌信號(hào)感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝進(jìn)行了研究,內(nèi)容主要分為以下兩個(gè)方面：1.金黃色葡萄球菌二元信號(hào)系統(tǒng)研究二元信號(hào)系統(tǒng)是一種廣泛存在于古細(xì)菌、真細(xì)菌及部分真菌和植物中的信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞系統(tǒng),能夠幫助生物體快速準(zhǔn)確應(yīng)答周邊環(huán)境中的多種刺激。在金黃色葡萄球菌中,二元信號(hào)系統(tǒng)作為一類毒性調(diào)控因子在維持細(xì)菌存活、侵染宿主以及抵抗抗生素殺傷等方面具有重要作用。目前已知在金黃色葡萄球菌基因組中存在16種二元信號(hào)系統(tǒng),其中大部分的功能被闡釋,但仍有少數(shù)尚未被系統(tǒng)研究�；诖�,我們選取了金黃色葡萄球菌中較少有報(bào)道的二元信號(hào)系統(tǒng)HptRSA與SAOUHSC_01313-1314作為研究對(duì)象。對(duì)于HptRSA,我們通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與大腸桿菌己糖磷酸吸收調(diào)控UhpABC具有高度同源性,因此實(shí)質(zhì)上這是一種三組份信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。我們發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌HptRSA缺失菌株無法再葡萄糖-6-磷酸作唯一碳源的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng),隨后的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果證實(shí)HptRSA能夠通過調(diào)控己糖磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體UhpT的表達(dá)促進(jìn)金黃色葡萄球菌對(duì)外源葡萄糖-6-磷酸的攝取。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌中UhpT轉(zhuǎn)運(yùn)體具有較高底物特異性,不能應(yīng)答其他多種磷酸糖。HprRSA系統(tǒng)中HptA蛋白能夠直接結(jié)合葡萄糖-6-磷酸,推斷其為葡萄糖-6-磷酸主要的感應(yīng)蛋白。此外,我們還證明了調(diào)控蛋白HptR能直接結(jié)合uhpT基因啟動(dòng)子,啟動(dòng)子區(qū)域30-bp長(zhǎng)度核苷酸序列為HptR識(shí)別所必需。對(duì)于SAOUHSC 01313-1314的功能研究尚在初步探索階段,敲除該二元信號(hào)系統(tǒng)對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)分裂,細(xì)胞膜形成等表型并沒有顯著影響。對(duì)于其感應(yīng)的刺激信號(hào)及調(diào)控的目標(biāo)基因則需要將來的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索,主要思路是在不同壓力條件下檢測(cè)該二元信號(hào)系統(tǒng)缺失菌株基因表達(dá)變化。2.金黃色葡萄球菌ABC (ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)體WmrAB的功能研究ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是一種利用ATP水解能量實(shí)現(xiàn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)出細(xì)胞膜的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)。金黃色葡萄球菌中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的報(bào)道主要集中于少數(shù)幾種抗生素轉(zhuǎn)運(yùn)體,許多ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能研究仍是空白。我們初步探索了金黃色葡萄球菌一種功能尚未報(bào)道的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體WmrAB。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WmrAB缺失的菌株呈現(xiàn)明顯降低的細(xì)胞自溶速率以及對(duì)糖肽類抗生素如萬古霉素、替考拉寧顯著減弱的敏感性,進(jìn)一步實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明敲除株細(xì)胞壁合成分解代謝相關(guān)基因如aaa、lytRS、ddl、walKR等轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)顯著變化,綜合效果很有可能使得細(xì)胞壁的代謝平衡出現(xiàn)某種紊亂。盡管基因位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)WmrAB與SAOUHSC_01313-1314相鄰,然而SAOUHSC_01313-1314敲除株中未檢測(cè)到wmrAB基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)明顯變化,另外凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)更證實(shí)了二元信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控蛋白與wmrAB并無直接結(jié)合,基本排除了SAOUHSC_01313-1314直接調(diào)控WmrAB的可能性。以上研究幫助我們更進(jìn)一步了解了金黃色葡萄球菌中二元信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體涉及的多種生理功能,對(duì)于前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)論進(jìn)行了完善與補(bǔ)充,進(jìn)一步完善了對(duì)金黃色葡萄球菌全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及轉(zhuǎn)運(yùn)代謝的認(rèn)識(shí),能夠?qū)τ陂_發(fā)與研究抗金黃色葡萄球菌感染藥物與治療這種病原菌引發(fā)的多種疾病提供一些新思路。但目前仍有一些問題尚未解決,諸如SAOUSC_01313-1314的感應(yīng)信號(hào),ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的關(guān)聯(lián)等方面則需要進(jìn)一步探索。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 二元信號(hào)系統(tǒng) 葡萄糖-6-磷酸 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體 細(xì)胞壁代謝
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.11
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 緒論13-43
• 1.1 金黃色葡萄球菌概述13-24
• 1.1.1 引言13-15
• 1.1.2 金黃色葡萄球菌主要致病因子15-19
• 1.1.3 金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁與自溶現(xiàn)象19-23
• 1.1.4 金黃色葡萄球菌主要毒性調(diào)控因子23-24
• 1.2 二元信號(hào)系統(tǒng)概述24-36
• 1.2.1 引言24-25
• 1.2.2 二元信號(hào)系統(tǒng)組成及分類25-28
• 1.2.3 幾種典型的二元信號(hào)系統(tǒng)28-29
• 1.2.4 二元信號(hào)系統(tǒng)的信號(hào)交聯(lián)29-30
• 1.2.5 金黃色葡萄球菌中的二元信號(hào)系統(tǒng)30-35
• 1.2.6 金黃色葡萄球菌二元信號(hào)系統(tǒng)研究現(xiàn)狀及未來方向35-36
• 1.3 ATP結(jié)合盒式(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體概述36-40
• 1.3.1 引言36-37
• 1.3.2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)構(gòu)和分類37-38
• 1.3.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體功能38-39
• 1.3.4 金黃色葡萄球菌中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體39-40
• 1.4 二元信號(hào)系統(tǒng)與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的關(guān)聯(lián)40-42
• 1.5 該課題研究?jī)?nèi)容和目的42-43
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料及方法43-65
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料43-48
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)條件43-44
• 2.1.2 所用試劑及培養(yǎng)基44-48
• 2.2 分子克隆操作48-54
• 2.2.1 所用引物48-51
• 2.2.2 所用載體51-52
• 2.2.3 基因片段PCR擴(kuò)增52
• 2.2.4 基因片段凝膠回收52-53
• 2.2.5 質(zhì)粒抽提轉(zhuǎn)化53
• 2.2.6 化學(xué)轉(zhuǎn)化外源基因進(jìn)入大腸桿菌53
• 2.2.7 金黃色葡萄球菌基因組抽提53-54
• 2.2.8 金黃色葡萄球菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備54
• 2.2.9 電轉(zhuǎn)化外源質(zhì)粒進(jìn)入金黃色葡萄球菌54
• 2.3 金黃色葡萄球菌敲除株獲得54-55
• 2.3.1 敲除載體構(gòu)建54-55
• 2.3.2 敲除菌株的篩選鑒定55
• 2.4 金黃色葡萄球菌回補(bǔ)菌株獲得55-56
• 2.5 敲除菌株表型實(shí)驗(yàn)56-58
• 2.5.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定56
• 2.5.2 生物膜形成能力檢測(cè)56
• 2.5.3 自溶能力檢測(cè)56-57
• 2.5.4 胞外蛋白酶明膠酶譜實(shí)驗(yàn)57
• 2.5.5 纖連蛋白粘附能力檢測(cè)57-58
• 2.5.6 金黃色葡萄球菌聚集能力檢測(cè)58
• 2.6 金黃色葡萄球菌總RNA分離純化58-59
• 2.7 反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR59
• 2.7.1 mRNA反轉(zhuǎn)錄59
• 2.7.2 cDNA實(shí)時(shí)定量PCR59
• 2.8 金黃色葡萄球菌表達(dá)譜芯片59-60
• 2.9 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)60
• 2.10 lacZ報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建60
• 2.11 報(bào)告質(zhì)粒的序列點(diǎn)突變60-61
• 2.12 基因?qū)嵪啾磉_(dá)水平檢測(cè)61
• 2.13 蛋白質(zhì)表達(dá)純化61-62
• 2.13.1 目的蛋白質(zhì)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)61
• 2.13.2 目的蛋白質(zhì)純化61-62
• 2.13.3 目的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定62
• 2.14 蛋白質(zhì)與目標(biāo)探針凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)62-63
• 2.15 等溫滴定微量熱試驗(yàn)(ITC)63-64
• 2.16 DNase Ⅰ足跡法實(shí)驗(yàn)(DNase Ⅰ footprinting assay)64
• 2.17 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析64-65
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析65-89
• 3.1 二元信號(hào)系統(tǒng)SAOUHSC_00184-00185研究結(jié)果及分析65-73
• 3.1.1 SAOUHSC_00184-00185現(xiàn)有研究背景65-66
• 3.1.2 HptRSA進(jìn)一步研究結(jié)果66-73
• 3.2 SAOUHSC_01313-1314及SAOUHSC_01311-1312初步研究結(jié)果73-89
• 3.2.1 基因位點(diǎn)及生物信息學(xué)分析73-75
• 3.2.2 基因敲除實(shí)驗(yàn)結(jié)果75-76
• 3.2.3 初步研究結(jié)果76-78
• 3.2.4 SAOUHSC_01313-1314進(jìn)一步研究進(jìn)展78-82
• 3.2.5 SAOUHSC_01311-1312進(jìn)一步研究進(jìn)展82-86
• 3.2.6 SAOUHSC_01313-1314對(duì)WmrAB不具有直接調(diào)控作用86-89
• 第四章 討論89-95
• 4.1 HptRSA系統(tǒng)功能的進(jìn)一步闡釋89-91
• 4.2 二元信號(hào)系統(tǒng)SAOUHSC_01313-1314的功能初步探索及解釋91-92
• 4.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體WmrAB功能初步探索及解釋92
• 4.4 工作總結(jié)92-95
• 參考文獻(xiàn)95-113
• 致謝113-115
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與其他研究成果115

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 白潔;機(jī)組配餐員的金黃色葡萄球菌污染情況[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè));2002年02期

2 朱自強(qiáng);;金黃色葡萄球菌更具殺傷力的原因在于其金黃色“外殼”[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2005年11期

3 杜洪利;張雙雙;歐旭;閆訓(xùn)友;;金黃色葡萄球菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J];食品與發(fā)酵科技;2009年05期

4 黃嶺芳;賴衛(wèi)華;張莉莉;;食品中金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J];食品與機(jī)械;2009年06期

5 王娉;勞華均;胡s

本文編號(hào)：360163