CPD和6-4PPs是紫外輻射造成的DNA損傷產(chǎn)物。光修復(fù)酶就是利用光能修復(fù)紫外損傷產(chǎn)物CPD和6-4PPs的一類黃素蛋白。根據(jù)結(jié)合的底物不同,分為CPD光修復(fù)酶和6-4光修復(fù)酶。我們的實(shí)驗(yàn)材料南極衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L是從南極中山站附近采集分離而來(lái)。南極衣藻長(zhǎng)期適應(yīng)極其惡劣的南極環(huán)境,尤其能抵抗南極強(qiáng)紫外輻射,我們推測(cè)南極衣藻C.sp.ICE-L的光修復(fù)酶能修復(fù)紫外輻射造成的藻細(xì)胞DNA損傷,保證了藻細(xì)胞DNA的完整性,光修復(fù)酶是南極衣藻適應(yīng)南極強(qiáng)紫外輻射環(huán)境的重要物質(zhì)。本文對(duì)南極衣藻C.sp.ICE-L的光修復(fù)酶家族進(jìn)行了初步探究。在我們實(shí)驗(yàn)室之前的實(shí)驗(yàn)中,已經(jīng)成功的從南極衣藻C.sp.ICE-L中得到了一個(gè)CPD光修復(fù)酶并驗(yàn)證了其具有修復(fù)CPD的活性。在此基礎(chǔ)上,本論文對(duì)南極衣藻C.sp.ICE-L轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了檢索,得到了南極衣藻C.sp.ICE-L的光修復(fù)酶家族基因,完成了南極衣藻光修復(fù)酶家族各基因的克隆表達(dá)及生物信息學(xué)分析,重點(diǎn)對(duì)6-4光修復(fù)酶的活性進(jìn)行了功能研究。并首次實(shí)現(xiàn)了南極衣藻C.sp.ICE-L CPD光修復(fù)酶和6-4光修復(fù)酶雙質(zhì)粒共表達(dá)體... 

【文章來(lái)源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：117 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

光損傷產(chǎn)物CPD和6-4PPs的化學(xué)結(jié)構(gòu)

復(fù)酶）的功能并不是完全分化的。顯然這些功能在高等植物和哺乳動(dòng)物中分化之前在其它物種中是共存的[50]。因此研究藻類的光修復(fù)酶能夠獲得關(guān)于光修復(fù)酶的新的發(fā)現(xiàn)。在第18次南極科考時(shí)在中山站旁的海冰上采集，并在本課題組中分離出來(lái)的南極衣藻C.sp.ICE-L，是南極冰藻類群中數(shù)量最多和最具代表性的一種綠藻。南極冰藻是南極環(huán)境中的一大類微藻，是南極地區(qū)重要的初級(jí)生產(chǎn)力；是南極食物鏈關(guān)鍵物種磷蝦的重要食物來(lái)源；在海洋生態(tài)平衡中起著非常重要的作用。南極衣藻C.sp.ICE-L是一種單胞真核藻，與模式生物萊茵衣藻同屬（圖2），是研究極端環(huán)境適應(yīng)機(jī)制的良好材料[58,59]。圖2南極衣藻C.sp.ICE-L顯微圖片F(xiàn)ig.2MicroscopicmorphologicalobservationofC.sp.ICE-L南極地區(qū)的極端環(huán)境被認(rèn)為能夠孕育特殊或罕見(jiàn)功能的生物，以適應(yīng)相應(yīng)的環(huán)境。而且南極地區(qū)的物種大都處于未開發(fā)的狀態(tài)，因此開發(fā)南極地區(qū)的種質(zhì)資源具有非常重要的意義[60]。除了嚴(yán)寒低溫、風(fēng)大干燥、極低的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)這些殘酷的生存環(huán)境外，南極地區(qū)還有很強(qiáng)的紫外輻射[61]。尤其是臭氧層被破壞甚至出現(xiàn)巨大空洞，紫外線顯著增強(qiáng)。而在這種嚴(yán)酷的環(huán)境中，南極衣藻C.sp.ICE-L依然旺盛生長(zhǎng)，使得我們推測(cè)南極衣藻C.sp.ICE-L能夠適應(yīng)南極環(huán)境的紫外線輻射，一定存在其獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制。早期的研究聚集在南極衣藻C.sp.ICE-L的細(xì)胞提取物，認(rèn)為藻細(xì)胞內(nèi)的一些提取物對(duì)于其在紫外輻射中生存起到了保護(hù)作用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在南極衣藻C.sp.ICE-L中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)光修復(fù)酶[62]，并且通過(guò)鑒定顯示了其修復(fù)CPD的功能，生物信息學(xué)分析表明其是CPD光修復(fù)酶II[63]。我們對(duì)南極衣藻C.sp.ICE-L的光修復(fù)酶家族有著極大的興趣。3

第一部分紫外輻射下南極衣藻嘧啶二聚體的形成與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序2)把提取好的南極衣藻C.sp.ICE-L的每個(gè)DNA樣品煮10min，然后迅速的進(jìn)行10min的冰浴，形成DNA單鏈。3)CPDs的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）�？贵w使用鼠抗CPDs單克隆抗體--小鼠單克隆抗體[H3]toThymineDimer（Abcam）。所有樣品進(jìn)行三次重復(fù)且樣品隨機(jī)點(diǎn)在96微孔板上（EvergreenScientific，USA）。4)取50μl的DNA單鏈于96微孔板中，90℃孵育1-2h，直到96微孔板干燥。ELISA實(shí)驗(yàn)使用的單克隆抗體是小鼠單克隆抗體[H3]toThymineDimer（Abcam），二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（上海生工）。5)加入100μL反應(yīng)底物（鄰苯二胺和用檸檬酸--磷酸鹽緩沖液配制的0.007%H2O2），黑暗中37℃，0.5h。加入50μL的2MH2SO4來(lái)終止顏色反應(yīng)。最終得到490nm的數(shù)值。4南極衣藻轉(zhuǎn)錄組測(cè)序南極衣藻C.sp.ICE-L轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由凌恩生物完成。實(shí)驗(yàn)以正常培養(yǎng)的光照濾去紫外線，作為對(duì)照組。紫外輻射（UVB，波長(zhǎng)312nm）設(shè)置三個(gè)梯度，分別為25，50和75μWcm-2，其它培養(yǎng)條件與正常培養(yǎng)條件一致，每個(gè)條件設(shè)置三個(gè)平行。照射時(shí)間為30min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束將藻液離心，干冰運(yùn)輸進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果1南極衣藻的DNA提取按照Trizol提取DNA的實(shí)驗(yàn)步驟提取南極衣藻C.sp.ICE-L的DNA，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1.1。結(jié)果顯示我們得到了純度較高的南極衣藻DNA。將提取的DNA標(biāo)記好，保存于-80℃超低溫冰箱待用。圖1.1南極衣藻C.sp.ICE-LDNA的電泳檢測(cè)Fig1.1DNAofC..sp.ICE-Ldetectedby1%agarosegelelectrophoresis7

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]DNA光修復(fù)酶體外活性的研究[J]. 徐蕾,沐萬(wàn)孟,羅昭鋒,王玉珍.  中國(guó)藥理學(xué)通報(bào). 2005(10)

博士論文
[1]大腸桿菌DNA光修復(fù)酶（photolyase）的表達(dá)純化及其活性研究[D]. 沐萬(wàn)孟.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 2006
[2]DNA光解酶作用機(jī)理的模型研究[D]. 湯文建.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 2006

碩士論文
[1]南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L α-碳酸酐酶（α-CAs）的克隆表達(dá)及功能研究[D]. 何英英.國(guó)家海洋局第一海洋研究所 2017
[2]南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L脂肪酸脫氫酶基因及其細(xì)胞膜流動(dòng)性調(diào)控分子機(jī)制研究[D]. 綦曉青.國(guó)家海洋局第一海洋研究所 2016
[3]南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L光修復(fù)酶基因及其修復(fù)DNA紫外損傷分子機(jī)制研究[D]. 李沖杰.國(guó)家海洋局第一海洋研究所 2015
[4]不同生境下南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L不飽和脂肪酸的研究及脂肪酸去飽和酶的功能驗(yàn)證[D]. 安美玲.國(guó)家海洋局第一海洋研究所 2014
[5]南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L光保護(hù)機(jī)制研究[D]. 牟善莉.國(guó)家海洋局第一海洋研究所 2012
[6]鹽生杜氏藻CPD光裂合酶基因DsPHR2的克隆、差異表達(dá)及功能鑒定[D]. 程龍.四川大學(xué) 2007



本文編號(hào)：3543409