CPD和6-4PPs是紫外輻射造成的DNA損傷產(chǎn)物。光修復(fù)酶就是利用光能修復(fù)紫外損傷產(chǎn)物CPD和6-4PPs的一類黃素蛋白。根據(jù)結(jié)合的底物不同,分為CPD光修復(fù)酶和6-4光修復(fù)酶。我們的實驗材料南極衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L是從南極中山站附近采集分離而來。南極衣藻長期適應(yīng)極其惡劣的南極環(huán)境,尤其能抵抗南極強紫外輻射,我們推測南極衣藻C.sp.ICE-L的光修復(fù)酶能修復(fù)紫外輻射造成的藻細(xì)胞DNA損傷,保證了藻細(xì)胞DNA的完整性,光修復(fù)酶是南極衣藻適應(yīng)南極強紫外輻射環(huán)境的重要物質(zhì)。本文對南極衣藻C.sp.ICE-L的光修復(fù)酶家族進行了初步探究。在我們實驗室之前的實驗中,已經(jīng)成功的從南極衣藻C.sp.ICE-L中得到了一個CPD光修復(fù)酶并驗證了其具有修復(fù)CPD的活性。在此基礎(chǔ)上,本論文對南極衣藻C.sp.ICE-L轉(zhuǎn)錄組進行了檢索,得到了南極衣藻C.sp.ICE-L的光修復(fù)酶家族基因,完成了南極衣藻光修復(fù)酶家族各基因的克隆表達(dá)及生物信息學(xué)分析,重點對6-4光修復(fù)酶的活性進行了功能研究。并首次實現(xiàn)了南極衣藻C.sp.ICE-L CPD光修復(fù)酶和6-4光修復(fù)酶雙質(zhì)粒共表達(dá)體... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：117 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

光損傷產(chǎn)物CPD和6-4PPs的化學(xué)結(jié)構(gòu)

復(fù)酶）的功能并不是完全分化的。顯然這些功能在高等植物和哺乳動物中分化之前在其它物種中是共存的[50]。因此研究藻類的光修復(fù)酶能夠獲得關(guān)于光修復(fù)酶的新的發(fā)現(xiàn)。在第18次南極科考時在中山站旁的海冰上采集，并在本課題組中分離出來的南極衣藻C.sp.ICE-L，是南極冰藻類群中數(shù)量最多和最具代表性的一種綠藻。南極冰藻是南極環(huán)境中的一大類微藻，是南極地區(qū)重要的初級生產(chǎn)力；是南極食物鏈關(guān)鍵物種磷蝦的重要食物來源；在海洋生態(tài)平衡中起著非常重要的作用。南極衣藻C.sp.ICE-L是一種單胞真核藻，與模式生物萊茵衣藻同屬（圖2），是研究極端環(huán)境適應(yīng)機制的良好材料[58,59]。圖2南極衣藻C.sp.ICE-L顯微圖片F(xiàn)ig.2MicroscopicmorphologicalobservationofC.sp.ICE-L南極地區(qū)的極端環(huán)境被認(rèn)為能夠孕育特殊或罕見功能的生物，以適應(yīng)相應(yīng)的環(huán)境。而且南極地區(qū)的物種大都處于未開發(fā)的狀態(tài)，因此開發(fā)南極地區(qū)的種質(zhì)資源具有非常重要的意義[60]。除了嚴(yán)寒低溫、風(fēng)大干燥、極低的營養(yǎng)物質(zhì)這些殘酷的生存環(huán)境外，南極地區(qū)還有很強的紫外輻射[61]。尤其是臭氧層被破壞甚至出現(xiàn)巨大空洞，紫外線顯著增強。而在這種嚴(yán)酷的環(huán)境中，南極衣藻C.sp.ICE-L依然旺盛生長，使得我們推測南極衣藻C.sp.ICE-L能夠適應(yīng)南極環(huán)境的紫外線輻射，一定存在其獨特的適應(yīng)機制。早期的研究聚集在南極衣藻C.sp.ICE-L的細(xì)胞提取物，認(rèn)為藻細(xì)胞內(nèi)的一些提取物對于其在紫外輻射中生存起到了保護作用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在南極衣藻C.sp.ICE-L中發(fā)現(xiàn)了第一個光修復(fù)酶[62]，并且通過鑒定顯示了其修復(fù)CPD的功能，生物信息學(xué)分析表明其是CPD光修復(fù)酶II[63]。我們對南極衣藻C.sp.ICE-L的光修復(fù)酶家族有著極大的興趣。3

第一部分紫外輻射下南極衣藻嘧啶二聚體的形成與轉(zhuǎn)錄組測序2)把提取好的南極衣藻C.sp.ICE-L的每個DNA樣品煮10min，然后迅速的進行10min的冰浴，形成DNA單鏈。3)CPDs的測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）�？贵w使用鼠抗CPDs單克隆抗體--小鼠單克隆抗體[H3]toThymineDimer（Abcam）。所有樣品進行三次重復(fù)且樣品隨機點在96微孔板上（EvergreenScientific，USA）。4)取50μl的DNA單鏈于96微孔板中，90℃孵育1-2h，直到96微孔板干燥。ELISA實驗使用的單克隆抗體是小鼠單克隆抗體[H3]toThymineDimer（Abcam），二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（上海生工）。5)加入100μL反應(yīng)底物（鄰苯二胺和用檸檬酸--磷酸鹽緩沖液配制的0.007%H2O2），黑暗中37℃，0.5h。加入50μL的2MH2SO4來終止顏色反應(yīng)。最終得到490nm的數(shù)值。4南極衣藻轉(zhuǎn)錄組測序南極衣藻C.sp.ICE-L轉(zhuǎn)錄組測序由凌恩生物完成。實驗以正常培養(yǎng)的光照濾去紫外線，作為對照組。紫外輻射（UVB，波長312nm）設(shè)置三個梯度，分別為25，50和75μWcm-2，其它培養(yǎng)條件與正常培養(yǎng)條件一致，每個條件設(shè)置三個平行。照射時間為30min。實驗結(jié)束將藻液離心，干冰運輸進行測序。結(jié)果1南極衣藻的DNA提取按照Trizol提取DNA的實驗步驟提取南極衣藻C.sp.ICE-L的DNA，電泳檢測結(jié)果見圖1.1。結(jié)果顯示我們得到了純度較高的南極衣藻DNA。將提取的DNA標(biāo)記好，保存于-80℃超低溫冰箱待用。圖1.1南極衣藻C.sp.ICE-LDNA的電泳檢測Fig1.1DNAofC..sp.ICE-Ldetectedby1%agarosegelelectrophoresis7

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]DNA光修復(fù)酶體外活性的研究[J]. 徐蕾,沐萬孟,羅昭鋒,王玉珍.  中國藥理學(xué)通報. 2005(10)

博士論文
[1]大腸桿菌DNA光修復(fù)酶（photolyase）的表達(dá)純化及其活性研究[D]. 沐萬孟.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 2006
[2]DNA光解酶作用機理的模型研究[D]. 湯文建.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 2006

碩士論文
[1]南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L α-碳酸酐酶（α-CAs）的克隆表達(dá)及功能研究[D]. 何英英.國家海洋局第一海洋研究所 2017
[2]南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L脂肪酸脫氫酶基因及其細(xì)胞膜流動性調(diào)控分子機制研究[D]. 綦曉青.國家海洋局第一海洋研究所 2016
[3]南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L光修復(fù)酶基因及其修復(fù)DNA紫外損傷分子機制研究[D]. 李沖杰.國家海洋局第一海洋研究所 2015
[4]不同生境下南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L不飽和脂肪酸的研究及脂肪酸去飽和酶的功能驗證[D]. 安美玲.國家海洋局第一海洋研究所 2014
[5]南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L光保護機制研究[D]. 牟善莉.國家海洋局第一海洋研究所 2012
[6]鹽生杜氏藻CPD光裂合酶基因DsPHR2的克隆、差異表達(dá)及功能鑒定[D]. 程龍.四川大學(xué) 2007



本文編號：3543409