本文關(guān)鍵詞：生物人工腎的優(yōu)化構(gòu)建及其治療多器官功能障礙綜合征的作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：血液凈化療法是急性腎衰竭(ARF)合并多器官功能障礙綜合征(MODS)最常用的治療方法。但ARF合并MODS死亡率仍居高不下,這與目前血液凈化技術(shù)僅能替代腎小球濾過功能,而不具備替代腎小管的功能,不能完成免疫、重吸收、內(nèi)分泌及代謝等功能密切相關(guān)。生物人工腎小管(RAD)就是利用細胞治療學(xué)和組織工程技術(shù)構(gòu)建出的一種裝置,以補充、完善目前血液凈化的不足。本課題組成功地應(yīng)用腎小管上皮細胞(RTCs)構(gòu)建了RAD,并在國內(nèi)率先完成了RAD的動物實驗。但我們在研究中發(fā)現(xiàn),符合臨床實際ARF合并MODS大動物模型的建立、細胞的來源與壽命等問題是RAD基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的瓶頸。因此,本研究創(chuàng)建缺血性ARF伴嚴重感染后MODS豬模型,探討ARF合并MODS與免疫失衡的關(guān)系；同時利用骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)與RTCs共培養(yǎng)來優(yōu)化RAD,為RAD提供最適細胞來源；用優(yōu)化構(gòu)建的RAD對ARF合并MODS豬模型進行治療,觀察其療效并探討其機制。第一部分 急性腎衰竭合并多器官功能障礙模型建立及其免疫功能研究目的：建立ARF伴MODS的豬模型,并探討ARF伴或不伴MODS動物血清中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)和炎性細胞因子水平是否有顯著差異,分析ARF合并MODS發(fā)生發(fā)展的免疫機制。方法：22只健康雜交豬,隨機分為三組。CLP+CRA組(n=12)：接受盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)造成腹腔感染致MODS,并夾閉腎動脈(CRA)致缺血性ARF；CLP組(n=5)：僅行CLP術(shù)；CRA組(n=5)：僅行CRA術(shù)。觀察其生命體征和主要臟器功能。ELISA方法測定手術(shù)后不同時間(0、4、8、16、24和48小時)血清NGAL、TNF-α和IL-6的水平。結(jié)果：(1)動物在CLP+CRA術(shù)后24-72小時陸續(xù)出現(xiàn)：ARF(血肌酐、尿素氮和鉀顯著升高),肝功能不全(ALT和AST顯著增加),平均動脈壓下降,肺功能異常,腎、肝、肺和小腸組織出現(xiàn)明顯的病理變化。(2)CLP+CRA組、CLP組血清TNF-α濃度8h時達到高峰,顯著高于同時間點的CRA組(621.50±207.31pg/ml、597.18±211.57pg/ml vs 194.82±57.06pg/ml, P＜0.01); CLP+CRA組、CLP組IL-6水平24h時顯著高于同時間點的CRA組(P0.01)。CLP+CRA組、CRA組血清NGAL濃度在8h時明顯高于同時間點的CLP組(463.08±7529ng/ml、 317.42±58.51ng/ml vs 132.67±43.58ng/ml, P0.05)。結(jié)論：盲腸結(jié)扎和穿孔造成嚴重腹腔感染致多器官功能障礙,加夾閉腎動脈致腎缺血再灌注性ARF,證明按本法制作ARF合并MODS模型成功、穩(wěn)定。動態(tài)監(jiān)測其TNF-α、IL-6和NGAL水平,可預(yù)測和評估ARF合并MODS的發(fā)生情況和嚴重程度。第二部分生物人工腎中細胞的優(yōu)化及丹參酮對其影響目的：建立人RTCs與骨髓MSCs體外最適共培養(yǎng)體系,為RAD的構(gòu)建提供理想細胞來源,并進行共培養(yǎng)的機制研究；同時,觀察丹參酮對共培養(yǎng)體系的影響。方法：(1)將人腎近曲小管上皮細胞(HK-2)和人骨髓MSCs分別按照1：1、3：1、6:1和10：1等不同比例共培養(yǎng)。觀察各組HK-2細胞形態(tài)和功能變化；檢測細胞存活率、細胞色素P450活性和細胞活力；激光共聚焦監(jiān)測巨蛋白(megalin)表達情況。(2)在HK-2和MSCs最適比例的共培養(yǎng)體系中加入丹參酮ⅡA磺酸鈉溶液(含100umol/L丹參酮ⅡA),設(shè)為丹參酮組；觀察丹參酮ⅡA對共培養(yǎng)體系的影響。流式細胞儀檢測與分析HK-2細胞周期變化、凋亡情況(Annexin V-FITC/PI法)；CCK8測定HK-2細胞增殖；ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)的水平。結(jié)果：(1)通過顯微鏡觀察,HK-2/MSCs 3:1共培養(yǎng)組為各組中HK-2細胞生長最佳；該組HK-2細胞存活率、細胞色素P450、細胞活力和megalin表達量均顯著高于其余比例組(P均0.05)。(2)細胞培養(yǎng)24h時,共培養(yǎng)組(HK-2/MSCs=3:1)、丹參酮組HK-2細胞G0-G1期比例較單純HK-2培養(yǎng)組(HK-2組)明顯減少,G2-S期比例則顯著增多(P0.05)；共培養(yǎng)組、丹參酮組培養(yǎng)24h、48h、72h細胞調(diào)亡率均明顯低于HK-2組(24h:1.74±0.03%、1.68±0.01% vs 2.75±0.02%,P0.05)；共培養(yǎng)組、丹參酮組HK-2在24h、48h細胞增殖能力均高于HK-2組(P0.05)；共培養(yǎng)組、丹參酮組在24h、48h時細胞培養(yǎng)上清液中IGF-1和BMP-7水平均高于HK-2組(P0.05)；但上述指標在共培養(yǎng)組與丹參酮組之間均未見顯著性差異(P0.05)。結(jié)論：HK-2與人骨髓MSCs體外共培養(yǎng)可維持HK-2形態(tài)與功能,HK-2與MSCs按3：1比例共培養(yǎng)可最大程度維持HK-2功能,為構(gòu)建功能性RAD提供了高效細胞材料。最適共培養(yǎng)體系中加入丹參酮ⅡA并未明顯促進細胞增殖、減少細胞凋亡及改善其功能。第三部分改良生物人工腎治療多器官功能障礙豬模型的作用及機制目的：觀察骨髓MSCs與HK-2共培養(yǎng)構(gòu)建的RAD治療ARF合并MODS豬的效果,探討其作用機制。方法：ARF并MODS豬隨機分為四組：①常規(guī)RAD治療組(A組,n=5),將單純HK-2培養(yǎng)構(gòu)建的RAD與血濾器連接,行RAD串聯(lián)CVVH治療24小時；②共培養(yǎng)RAD治療組(B組,n=5),RAD中細胞為共培養(yǎng)后HK-2,余同A組；③假RAD治療組(C組,n=5),將RAD換為無細胞的假RAD,余同A組；④未血液凈化治療組(D組,n=6)。觀察和記錄生命體征、生化指標(包括血肌酐、尿素氮、電解質(zhì))、血氣分析、細胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和生存時間。結(jié)果：四組動物治療前MAP無顯著性差異,均值為79.13±12.06mmHg; A、B兩組治療4h后血壓逐漸回升,24h時B組MAP (101.20±9.37mmHg),顯著高于同時間點的A組(93.42±7.35mmHg)、C組(64.75±9.61mmHg)和D組(54.29±3.01mmHg) (P0.05)。四組CWH前SCr無明顯差異；治療24h A、B組SCr水平明顯低于C、D組(P0.05),而A、B組之間無顯著性差異。B組IL-10的峰值(301.72±46.35pg/m1),明顯高于A組(261.33±51.72pg/ml)、C組(130.47±14.97pg/ml)、D組(104.11±10.89pg/ml) (P0.05)。各組治療開始前血TNF-a水平無統(tǒng)計學(xué)差異,均值為519.33±42.16pg/ml; A. B兩組治療開始后血TNF-a水平逐漸下降,24h時均值分別為413.65±33.91pg/ml、329.51±27.64pg/ml,兩組有顯著性差異(30.05)。A、B、C三組治療前后血清IL-6水平無明顯改變,但D組血清IL-6濃度進行性升高。B組的平均生存時間為124.38±17.09h,明顯長于A組(110.97±10.68h)、C組(81.68±9.41h)和D組(75.29±13.71h)(P0.05),前者的平均生存期比后三者分別延長了12.08%、52.28%、65.20%。結(jié)論：采用RTCs與骨髓MSCs共培養(yǎng)優(yōu)化構(gòu)建的RAD(改良RAD)治療ARF合并MODS,在延長生存時間和改善生命體征等方面明顯優(yōu)于常規(guī)RAD治療,其機制可能是改良RAD進一步抑制致炎因子產(chǎn)生和增加抑炎因子表達。
【關(guān)鍵詞】：多器官功能障礙綜合征 生物人工腎小管 骨髓間充質(zhì)干細胞 白介素-10 腫瘤壞死因子-α 白介素-6
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7;R692.5
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-18
• 參考文獻16-18
• 第一部分 急性腎損傷合并多器官功能障礙模型建立及其免疫功能研究18-40
• 材料與方法20-23
• 結(jié)果23-33
• 討論33-36
• 參考文獻36-40
• 第二部分 生物人工腎中細胞的優(yōu)化及丹參酮對其影響40-63
• 材料與方法42-48
• 結(jié)果48-58
• 討論58-60
• 結(jié)論60
• 參考文獻60-63
• 第三部分 改良生物人工腎治療多器官功能障礙豬模型的作用及機制63-83
• 材料與方法64-69
• 結(jié)果69-77
• 討論77-80
• 參考文獻80-83
• 全文總結(jié)83-84
• 附錄 綜述84-93
• 參考文獻89-93
• 英文縮略詞表93-95
• 攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果95-97
• 致謝97-98
• 作者簡介98

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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  本文關(guān)鍵詞：生物人工腎的優(yōu)化構(gòu)建及其治療多器官功能障礙綜合征的作用及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：351887