本文關(guān)鍵詞：奧曲肽偶聯(lián)殼聚糖miR-155分子信標(biāo)納米成像非小細(xì)胞肺癌實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的:近年來,我國肺癌發(fā)病率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。目前臨床上缺乏特異的、敏感的肺癌早期診斷以及治療性分子靶標(biāo)。腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cell,CSC)被認(rèn)為是腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源,尋找肺癌干細(xì)胞有可能成為其早期診斷和治療的新的突破點(diǎn)。大量研究表明微小RNA(micro RNA,mi RNA)廣泛參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、血管生成和耐藥等,識(shí)別肺癌或肺癌干細(xì)胞相關(guān)的mi RNA有可能成為肺癌早期診斷的重要策略。分子信標(biāo)是一種分子內(nèi)互補(bǔ)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記的寡核苷酸序列,是一個(gè)非常敏感的檢測(cè)DNA、RNA和micro RNA的方法,已被廣泛用于基因定量分析、疾病診斷和活體成像等研究領(lǐng)域。殼聚糖作為一種天然陽離子多糖,被廣泛用于介導(dǎo)質(zhì)粒、小干擾RNA(Small interfering RNA,si RNA)等基因轉(zhuǎn)染。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)殼聚糖納米(Chitosan,CS)可介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染,且具有較高的安全性和有效性。本課題組前期以殼聚糖納米作為載體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA并取得了較理想的結(jié)果。由于不同組織的高通透性和滯留效應(yīng)(Enhanced permeability and retention effect,EPR)存在差距,利用納米材料的被動(dòng)靶向策略通常達(dá)不到較理想的靶向效果;而腫瘤細(xì)胞表面有很多特異性的受體或抗原可以用來區(qū)分正常細(xì)胞,可以通過將納米材料表面偶聯(lián)具有特異性的多肽和單克隆抗體,使之與癌細(xì)胞表面的抗原或受體特異性結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性診斷與治療,生長(zhǎng)抑素受體2(somatostatin receptor2,SSTR2)就是其中的代表。因此,本研究擬以非小細(xì)胞肺癌(non-small sell lung cancer,NSCLC)為疾病模型,從A549肺癌細(xì)胞系中分選CD133+CD326+雙陽性細(xì)胞并驗(yàn)證其是否為肺癌干細(xì)胞(lung cancer stem cell,LCSC),而后采用分子信標(biāo)(molecular beacon,MB)技術(shù)和納米技術(shù)相結(jié)合,并進(jìn)行靶向多肽奧曲肽(Octreotide,OCT)偶聯(lián),利用OCT可以與細(xì)胞表明的SSTR2受體特異性結(jié)合這一特點(diǎn),通過識(shí)別肺癌細(xì)胞或肺癌干細(xì)胞中高表達(dá)的micro RNA達(dá)到識(shí)別肺癌細(xì)胞或肺癌干細(xì)胞的目的,為肺癌的診斷提供新思路、新方法和新技術(shù)。方法:1.通過流式細(xì)胞儀從A549細(xì)胞中分選出CD133+CD326+雙陽性細(xì)胞并對(duì)其干性進(jìn)行鑒定,采用熒光定量PCR方法檢測(cè)mi R-155的表達(dá)。2.根據(jù)mi R-155序列設(shè)計(jì)并合成鎖核酸修飾的mi R-155分子信標(biāo)(mi R-155 MB),同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照,即不和任何基因序列結(jié)合的隨機(jī)序列(random sequence,RS)分子信標(biāo),采用液相分子雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)設(shè)計(jì)的mi R-155 MB和RS MB分子信標(biāo)的特異性及靈敏性。3.采用自組裝方法合成殼聚糖mi R-155分子信標(biāo)納米(CS-mi R-155 MB)并對(duì)其粒徑大小、zeta電位、分散度、抗DNase I等理化性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。以殼聚糖納米做為載體轉(zhuǎn)染mi R-155 MB,同時(shí)以RS MB作為陰性對(duì)照,激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)mi R-155MB對(duì)NSCLC細(xì)胞及LCSC中mi R-155的識(shí)別功能并成像,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證,以PC-3細(xì)胞作為陽性對(duì)照;進(jìn)一步在皮下移植瘤和肺移植瘤活體動(dòng)物水平上檢測(cè)CS-mi R-155 MB對(duì)NSCLC細(xì)胞及LCSC中mi R-155的識(shí)別功能并成像。同時(shí)以商品化的脂質(zhì)體si PORT試劑作為載體轉(zhuǎn)染mi R-155 MB,通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度和轉(zhuǎn)染效率比較殼聚糖納米和脂質(zhì)體作為mi R-155 MB載體對(duì)mi R-155的檢測(cè)及成像功能。4.免疫熒光技術(shù)檢測(cè)NSCLC細(xì)胞及皮下移植瘤組織中SSTR2的表達(dá),同時(shí)采用化學(xué)修飾方法制備靶向奧曲肽偶聯(lián)的殼聚糖分子信標(biāo)納米復(fù)合物(CS-MB-OCT)并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。在細(xì)胞水平上、皮下移植瘤和肺移植瘤活體動(dòng)物水平上檢測(cè)CS-MB-OCT對(duì)NSCLC細(xì)胞中mi R-155的識(shí)別功能并成像,并通過檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度及流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效率來比較商品化的脂質(zhì)體si PORT轉(zhuǎn)染試劑、CS-MB及CS-MB-OCT三者作為mi R-155 MB載體對(duì)mi R-155的檢測(cè)及成像功能。結(jié)果:1.分選的CD133+CD326+雙陽性細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中成球生長(zhǎng),在細(xì)胞數(shù)為1×104數(shù)量下仍具備成瘤能力,干性相關(guān)基因CD133、CD326、OCT-4、Nanog表達(dá)為A549細(xì)胞的3倍之上,mi R-155的表達(dá)為A549細(xì)胞的2.63倍。2.液相分子雜交實(shí)驗(yàn)中mi R-155+mi R-155 MB組熒光強(qiáng)度為mi R-155 MB組的55倍,RS+RS MB組的熒光強(qiáng)度為RS MB組的41倍,表明設(shè)計(jì)的鎖核酸修飾的mi R-155MB能夠很好的識(shí)別mi R-155,具有較高的特異性和靈敏性。3.按照7:1的質(zhì)量比合成CS-MB,其粒徑范圍在15 80 nm,平均粒徑31.95±3.28 nm,zeta電位+20.1±2.14 mv,能夠抵抗DNase I的降解;孵育細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞存活率仍在90%以上,適合基因轉(zhuǎn)染。在細(xì)胞水平上,CS轉(zhuǎn)染mi R-155 MB后可在NSCLC細(xì)胞及LCSC細(xì)胞漿中看到較強(qiáng)的紅色熒光,且熒光信號(hào)強(qiáng)弱趨勢(shì)與熒光定量PCR檢測(cè)的mi R-155的表達(dá)趨勢(shì)一致,RS MB組未檢測(cè)到熒光信號(hào)。在活體動(dòng)物水平上,CS轉(zhuǎn)染mi R-155 MB后能夠在NSCLC皮下移植瘤組織中檢測(cè)到較強(qiáng)的紅色熒光,RS MB組未檢測(cè)到熒光信號(hào)。殼聚糖納米轉(zhuǎn)染效率在各組細(xì)胞之間約為75% 85%,和商品化的si PORT脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑相比,具有較高的熒光信號(hào)和轉(zhuǎn)染效率。4.免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SSTR2在NSCLC細(xì)胞及皮下移植瘤組織中都有表達(dá),可作為奧曲肽特異結(jié)合的定向靶標(biāo)。采用化學(xué)修飾方法以戊二醛為交聯(lián)劑合成CS-MB-OCT,其粒徑范圍為30 130 nm,平均粒徑為82.28±1.24 nm。在細(xì)胞水平上,CS-mi R155 MB-OCT能夠發(fā)揮其靶向作用,和腫瘤細(xì)胞表面的SSTR2特異性結(jié)合,對(duì)NSCLC細(xì)胞中mi R-155的識(shí)別功能并成像,孵育時(shí)間更短,需1小時(shí),轉(zhuǎn)染效率約為90% 95%,紅色熒光信號(hào)更強(qiáng),CS-RS MB-OCT組未檢測(cè)到熒光信號(hào)。在皮下移植瘤和肺移植瘤活體動(dòng)物水平上,CS-mi R155 MB-OCT能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)NSCLC皮下移植瘤及肺移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞的mi R-155識(shí)別并成像,與CS-mi R155 MB相比,熒光信號(hào)和轉(zhuǎn)染效率更高。結(jié)論:1.從A549細(xì)胞中分選的CD133+CD326+雙陽性細(xì)胞具有干細(xì)胞特性,并高表達(dá)mi R-155。設(shè)計(jì)的鎖核酸修飾的mi R-155 MB能夠特異性的識(shí)別mi R-155并具有較高的靈敏性。2.合成的CS-mi R-155 MB納米復(fù)合物能夠在細(xì)胞水平、皮下移植瘤和肺移植瘤動(dòng)物水平上對(duì)NSCLC細(xì)胞或LCSC中的mi R-155進(jìn)行識(shí)別并成像,通過識(shí)別NSCLC細(xì)胞或LCSC中高表達(dá)的mi R-155對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行成像。3.和CS-mi R155 MB納米復(fù)合物相比,合成的CS-mi R155 MB-OCT納米復(fù)合物能夠發(fā)揮其靶向作用,和腫瘤細(xì)胞表面的生長(zhǎng)抑素受體特異性結(jié)合,在細(xì)胞水平、皮下移植瘤和肺移植瘤活體動(dòng)物水平上更好的對(duì)NSCLC細(xì)胞中的mi R-155進(jìn)行識(shí)別并成像,為肺癌的診斷提供了新思路、新方法和新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：非小細(xì)胞肺癌 肺癌干細(xì)胞 miR-155 分子信標(biāo) 殼聚糖納米 奧曲肽 分子成像
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-17
• 第二章 CD133~+CD326~+細(xì)胞亞群的分選及干性鑒定17-34
• 2.1 引言17
• 2.2 材料與方法17-27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-31
• 2.4 討論31-33
• 2.5 小結(jié)33-34
• 第三章 殼聚糖mi R-155分子信標(biāo)納米成像NSCLC的實(shí)驗(yàn)研究34-67
• 3.1 引言34
• 3.2 材料與方法34-43
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-58
• 3.4 討論58-65
• 3.5 小結(jié)65-67
• 第四章 奧曲肽偶聯(lián)殼聚糖mi R-155分子信標(biāo)納米成像NSCLC的實(shí)驗(yàn)研究67-91
• 4.1 引言67
• 4.2 材料與方法67-73
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果73-84
• 4.4 討論84-90
• 4.5 小結(jié)90-91
• 全文總結(jié)91-92
• 參考文獻(xiàn)92-103
• 文獻(xiàn)綜述 殼聚糖納米在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用103-114
• 參考文獻(xiàn)109-114
• 攻讀博士學(xué)位期間的研究成果114-115
• 致謝115

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：奧曲肽偶聯(lián)殼聚糖miR-155分子信標(biāo)納米成像非小細(xì)胞肺癌實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：351063