本文關(guān)鍵詞：Furin和PCSK6對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是以滑膜慢性炎癥、關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞為特點的一種系統(tǒng)性疾病�；ひr里層的成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)在RA的發(fā)病中起到了關(guān)鍵作用。弗林蛋白酶(furin)是前體蛋白轉(zhuǎn)化酶(proprotein convertases, PCs)家族的重要成員之一,參與多種活性肽前體的活化過程。且furin在RA的滑膜翳和FLS中呈現(xiàn)出高表達(dá)。我們的論文著重研究furin對RA的FLS生物學(xué)功能的影響。另外,枯草桿菌樣蛋白原轉(zhuǎn)化酶(proprotein convertase subtilisin/kexin type 6, PCSK6)也是PC家族成員之一,在RA的滑膜中也表型出高表達(dá),我們同時也研究了PCSK6在RA的FLS中的作用,以分析兩者的作用是否相似。中文論文分為四個部分：第一部分為綜述：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞；第二部分為綜述：弗林蛋白酶furin——胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生：第三部分：抑制furin表達(dá)對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響；第四部分：抑制PCSK6對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響。第一部分類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨的破壞為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,目前在臨床上雖然治療手段很多,但仍沒有特異性的治愈方法。RA的發(fā)病機制極其復(fù)雜,包含許多類型細(xì)胞的參與：T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和FLS。分布于滑膜襯里層的FLS通過分泌多種介質(zhì),包括細(xì)胞因子、化學(xué)因子、生長因子和其他的一些促炎性分子如前列腺素和白介素等,在炎癥的發(fā)生、維持、關(guān)節(jié)軟骨破壞過程中到起關(guān)鍵作用。RA的FLS可以表現(xiàn)出一些腫瘤細(xì)胞的特性,可能與P53基因功能的失活有關(guān),產(chǎn)生獨特的侵襲性表型,使其能夠侵襲細(xì)胞外基質(zhì),進一步加劇關(guān)節(jié)損傷。FLS是RA發(fā)病過程中的關(guān)鍵因子之一。最近針對FLS的生物學(xué)研究進展包括它對固有免疫的調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)信號通路的調(diào)節(jié)等。對FLS的深入研究可以發(fā)現(xiàn),FLS可以作為RA患者的一個新的治療靶點,從而完善目前RA的治療。第二部分弗林蛋白酶furin-——胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生弗林蛋白酶furin在體內(nèi)介導(dǎo)了一個簡單的生化反應(yīng),催化前體蛋白水解為成熟蛋白。雖然這個反應(yīng)看似簡單,furin生理作用卻極其重要。它參與了人體內(nèi)的多種生理過程,是維持人體穩(wěn)態(tài)平衡的重要分子。與furin相關(guān)的疾病相當(dāng)廣泛,包括：阿爾茨海默病、腫瘤、炭疽和埃博拉出血熱等等。本篇綜述主要概括了furin的結(jié)構(gòu)、活性、細(xì)胞內(nèi)定位、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、作用底物、生物學(xué)特性以及與胚胎發(fā)生和多種疾病的關(guān)系。第三部分抑制furin表達(dá)對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響研究背景類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎RA是以滑膜慢性炎癥、關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞為特點的一種系統(tǒng)性疾病。在RA中,正�；南鄬Φ撵o止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋承院颓忠u性的滑膜翳組織。RA的發(fā)病機制非常復(fù)雜,多種細(xì)胞類型參與其中,如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞。其中,滑膜襯里層的FLS在RA的發(fā)病中起到了關(guān)鍵作用。FLS分泌一系列細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)以及多種蛋白水解酶,介導(dǎo)局部的炎癥反應(yīng),以及參與降解細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨蛋白。RA患者來源的FLS的生物學(xué)特性不同于健康個體或骨性關(guān)節(jié)炎患者。這些炎性滑膜來源的滑膜細(xì)胞表現(xiàn)出一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型特征,如細(xì)胞的錨定不依賴性生長、過度增殖、細(xì)胞侵襲、以及對凋亡誘導(dǎo)的耐受等。在體外培養(yǎng)此類細(xì)胞時,這些滑膜細(xì)胞在沒有T細(xì)胞存在的情況下仍然可以長時間保持其侵襲力和破壞力。說明RA的關(guān)節(jié)破壞除了T細(xì)胞參與的自身免疫調(diào)節(jié)等機制,也有不依賴T細(xì)胞的以FLS為中心的機制。這類滑膜細(xì)胞是關(guān)節(jié)自分泌/旁分泌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子,加重關(guān)節(jié)滑膜慢性炎性狀態(tài)和關(guān)節(jié)破壞。RA的最近的一些治療進展主要集中于針對炎性細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞免疫的生物治療,如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)抑制劑,T細(xì)胞共刺激信號抑制劑,和B細(xì)胞清除劑等。在部分患者中這些生物治療是有效的。但仍有很大一部分患者對以上這些生物制劑沒有應(yīng)答。因此,尋找新的治療靶點,尤其是針對RA的FLS的治療可能會完善現(xiàn)有治療方案。Furin是PCs家族的重要成員之一,廣泛分布于機體各種細(xì)胞中。Furin主要位于細(xì)胞內(nèi)高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)(trans-Golgi network, TGN),并在高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞膜之間循環(huán)轉(zhuǎn)運。Furin能夠通過識別、剪切特定序列Arg-Xaa-(Lys/Arg)-Arg,水解多種前體蛋白,這一剪切過程是多種蛋白成熟活化的關(guān)鍵步驟,對蛋白質(zhì)的功能起到重要的調(diào)節(jié)作用。最近的研究表明,furin參與了胚胎發(fā)育、機體穩(wěn)態(tài)和多種疾病發(fā)生發(fā)展等過程。然而在生殖細(xì)胞中敲除furin會使胚胎死亡,因此furin在各種細(xì)胞中的作用缺乏基因敲除動物這種有利的研究手段。既往有實驗發(fā)現(xiàn)RA患者的關(guān)節(jié)滑膜翳中furin的表達(dá)明顯增加,但機制和作用尚不明了。Furin表達(dá)的上調(diào)可能會促進關(guān)節(jié)滑膜炎癥,也可能是滑膜對炎癥反應(yīng)或自身免疫時的一種代償。因此,研究滑膜細(xì)胞上高表達(dá)的furin的作用是一個亟需解決的課題。為了研究這個課題,我們設(shè)計了一系列實驗。將RA患者來源的FLS進行體外培養(yǎng),將其高表達(dá)的furin使用RNA干擾技術(shù)進行基因抑制,研究抑制furin對滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、分泌炎癥因子的影響。從而證明furin在滑膜細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用。研究目的探索RA患者FLS細(xì)胞上高表達(dá)的furin對細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。研究方法我們從RA患者行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后的滑膜組織中消化分離FLS進行體外培養(yǎng),瞬時轉(zhuǎn)染小干擾RNA抑制細(xì)胞內(nèi)furin表達(dá),并設(shè)置對照組小干擾RNA,驗證siRNA-furin的干擾效率。進一步的研究使用兩組furin差異表達(dá)的FLS進行以下功能學(xué)實驗：(1)MTT細(xì)胞增殖實驗；(2)Transwell細(xì)胞侵襲實驗；(3)單層細(xì)胞劃痕實驗；(4)細(xì)胞周期分析；(5)細(xì)胞凋亡分析；(6)酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測FLS分泌白細(xì)胞介素(interleukin, IL)IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17和TNF-a水平。研究兩組細(xì)胞在增殖、侵襲、遷移、凋亡、分泌等生物學(xué)功能中的差異。結(jié)果我們利用siRNA-furin或siRNA-control干擾RA患者的FLS上furin的表達(dá),研究其功能差別。得到以下結(jié)果：(1) siRNA-furin在mRNA水平和蛋白水平均有效抑制FLS的furin表達(dá)。(2)RA滑膜來源的FLS上furin表達(dá)的下調(diào)增強FLS細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力；(3)抑制furin表達(dá)加速FLS的細(xì)胞周期；(4)抑制furin表達(dá)影響FLS的凋亡,晚期凋亡和壞死細(xì)胞減少；(5)抑制furin的表達(dá)使FLS分泌TNF-a和IL-1β增加；結(jié)論(1)抑制RA滑膜FLS細(xì)胞上furin的表達(dá)增強了FLS細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子等功能；(2)RA滑膜細(xì)胞上furin的高表達(dá)可能是一種代償性反應(yīng),抑制滑膜細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等表型；(3) Furin在循環(huán)和局部的作用不盡相同,具體機制有待進一步研究。研究意義RA是一種高度異質(zhì)性疾病,炎癥、免疫、代謝等多個方面參與其發(fā)病機制。毫無疑問,關(guān)節(jié)滑膜襯里層的FLS是疾病的關(guān)鍵因子之一。我們發(fā)現(xiàn),抑制RA滑膜細(xì)胞上高表達(dá)的furin基因會增強細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子的能力。因此furin可能會作為RA的治療靶點之一從而完善現(xiàn)有治療。第四部分抑制PCSK6對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎RA是以滑膜慢性炎癥、關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞為特點的一種系統(tǒng)性疾病。RA來源的FLS表現(xiàn)出類似轉(zhuǎn)化細(xì)胞的侵襲特性,通過分泌一系列細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)以及多種蛋白水解酶,介導(dǎo)局部的炎癥反應(yīng),參與降解細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨蛋白,加重RA的關(guān)節(jié)損害。PCSK6是一種Ca2+依賴的絲氨酸蛋白水解酶,參與多種肽的活化過程。既往研究顯示PCSK6具有增強腫瘤細(xì)胞侵襲性和增值能力的作用。而且與骨性關(guān)節(jié)炎相比,PCSK6在RA滑膜上表達(dá)增高。因此我們設(shè)計一系列實驗研究PCSK6對RA來源的FLS生物學(xué)功能的影響。研究目的探索RA患者FLS細(xì)胞上PCSK6的表達(dá)對細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。方法和結(jié)果我們從RA患者行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后的滑膜組織中消化分離FLS進行體外培養(yǎng),應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染FLS細(xì)胞抑制PCSK6表達(dá),并行qRT-PCR和Western blot檢測驗證PCSK6在mRNA和蛋白水平表達(dá)的降低。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后進行的功能學(xué)實驗包括：(1)MTT細(xì)胞增殖實驗,證明抑制RA FLS細(xì)胞PCSK6表達(dá)降低細(xì)胞的增殖能力；(2)Transwell細(xì)胞侵襲實驗,證明降低RA FLS細(xì)胞PCSK6表達(dá)抑制FLS細(xì)胞的侵襲能力；(3)單層細(xì)胞劃痕實驗,證明抑制]PCSK6表達(dá)后RA FLS細(xì)胞遷移能力降低；(4)ELISA檢測FLS分泌功能,證明抑制]PCSK6的表達(dá)使RA FLS分泌TNF-α水平降低。結(jié)論(1)抑制PCSK6的表達(dá)降低了RA滑膜FLS細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子等功能；(2)RA滑膜細(xì)胞上高表達(dá)的PCSK6可能通過促進FLS的增殖、侵襲、遷移等加速RA的關(guān)節(jié)損害；(3) PCSK6和furin雖然同屬PCs家族,但對RA FLS細(xì)胞生物學(xué)功能的影響不同,具體機制有待進一步研究。研究意義PCSK6和furin雖然同屬PCs家族,但在RA的關(guān)鍵致病因子之一FLS細(xì)胞的生物學(xué)功能中的影響卻不同。其中涉及的發(fā)病機制極其復(fù)雜。需要我們的進一步研究。因此PCs家族可能成為RA的新的研究熱點,以期在RA的發(fā)病機制和治療中尋找關(guān)鍵靶點。
【關(guān)鍵詞】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 furin 成纖維樣滑膜細(xì)胞 RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22
【目錄】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-17
• 符號說明17-19
• 第一部分 綜述 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞19-31
• 參考文獻(xiàn)28-31
• 第二部分 綜述 弗林蛋白酶furin——胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生31-41
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 第三部分 抑制furin表達(dá)對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響41-73
• 前言41-44
• 材料與方法44-57
• 結(jié)果57-63
• 討論63-67
• 結(jié)論67-68
• 研究意義68-69
• 參考文獻(xiàn)69-73
• 第四部分 抑制PCSK6對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響73-83
• 前言73-75
• 方法和結(jié)果75-77
• 討論77-79
• 結(jié)論79-80
• 研究意義80-81
• 參考文獻(xiàn)81-83
• 致謝83-84
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄84-85
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表85-86
• 發(fā)表英文論文186-107
• 發(fā)表英文論文2107-121
• 發(fā)表英文論文3121-135

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：349742