本文關(guān)鍵詞：DKK1抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及其相關(guān)分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)的發(fā)病率與日俱增,易損斑塊發(fā)生的破裂和繼發(fā)的血栓形成,是誘發(fā)急性冠脈綜合征、心肌梗死和中風(fēng)等多種疾病的主要機(jī)制之一。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,動(dòng)脈粥樣硬化始于血管壁內(nèi)皮損傷,單核細(xì)胞募集并遷入內(nèi)膜下轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞,識(shí)別并吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞,同時(shí)募集白細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等進(jìn)入斑塊,積聚脂質(zhì)、中央核心壞死,導(dǎo)致斑塊破裂的發(fā)生。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的重要因素。研究發(fā)現(xiàn),ox-LDL可以損傷內(nèi)皮,誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化,促進(jìn)平滑肌增殖遷移,加速泡沫細(xì)胞形成,引起炎癥反應(yīng),加劇脂質(zhì)沉積等動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn),Wnt信號(hào)通路參與細(xì)胞粘附、干細(xì)胞更新、腫瘤發(fā)生和細(xì)胞分化、增殖、遷移、組織發(fā)生等多種分子生物學(xué)變化。各種環(huán)境因素能夠調(diào)節(jié)Wnt通路的啟動(dòng)和關(guān)閉,通過結(jié)合胞膜上的LRP5/6等受體,調(diào)節(jié)胞質(zhì)中的β-catenin的積累和降解,影響(3-catenin的靶基因表達(dá)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能變化。Wnt通路存在許多胞外拮抗分子,其中DKK家族是一種分泌型拮抗蛋白,除DKK3外的DKK亞家族成員(DKK1,2,4)均可參與Wnt信號(hào)調(diào)控。目前有關(guān)DKK家族中研究最多的蛋白為DKK1。DKK1與心血管疾病的發(fā)生存在著密切的關(guān)系,而在ox-LDL刺激下巨噬細(xì)胞內(nèi)的DKK1表達(dá)水平存在著怎樣的變化尚未見報(bào)道。研究目的：(1)明確ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞中DKK1的調(diào)節(jié)作用；(2)明確LXRs在ox-LDL調(diào)節(jié)DKK1中的作用；(3)明確β-catenin與LXRs的相互作用在ox-LDL調(diào)節(jié)DKK1中的作用。研究方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)購自ATCC的人單核/巨噬細(xì)胞系以RPMI-1640(含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)懸浮培養(yǎng)。并以終濃度為160nM的PMA誘導(dǎo)貼壁為巨噬細(xì)胞,作為實(shí)驗(yàn)的模型細(xì)胞。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染β-catenin、LXRa和LXRβ的siRNA和陰性對(duì)照Negative control siRNA均由上海吉瑪公司合成,按照脂質(zhì)體Lipo-2000的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染后,給予不同的刺激并檢測(cè)。3.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)提取不同刺激后細(xì)胞的蛋白,99℃加熱10分鐘,SDS-PAGE電泳,按照對(duì)應(yīng)的分子量切膠,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育4℃過夜,洗膜后二抗孵育1小時(shí)20分鐘,洗去附著的二抗,化學(xué)發(fā)光,分析對(duì)應(yīng)的蛋白條帶的灰度值。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析刺激結(jié)束后利用Trizol法提取細(xì)胞中的總核糖核酸(Ribonucleic Acid, RNA),測(cè)定提取的RNA濃度,使用TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary Deoxyribonucleic Acid, cDNA),再使用TaKaRa公司的SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng),以測(cè)定DKKl和內(nèi)參蛋白的mRNA表達(dá)情況。5.DKK1濃度的測(cè)定使用RD公司的Human DKK1 Immunoassay ELISA試劑盒檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌到胞外的DKK1濃度。按照ELISA試劑盒說明書配制DKKl標(biāo)準(zhǔn)品并稀釋樣品,添加到事先包被有DKK1單克隆抗體的96孔酶標(biāo)板中,并依次加入說明書中相應(yīng)的試劑,使用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm各孔吸光度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算不同刺激下分泌到胞外的DKK1濃度。6.免疫共沉淀不同刺激后使用Western及IP細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中總蛋白,留取部分加入5×蛋白上樣緩沖液后煮沸留作對(duì)照,剩余蛋白裂解液中加入事先配好的50%瓊脂糖磁珠和合適濃度的一抗原液4℃孵育過夜,清洗瓊脂糖磁珠后,加入2×蛋白上樣緩沖液后煮沸,使得結(jié)合在磁珠上的蛋白脫離,留取上清棄磁珠,Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的含量。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組之間的統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析,P0.05代表統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。研究結(jié)果1. ox-LDL上調(diào)巨噬細(xì)胞DKKl的表達(dá)100mg/L ox-LDL刺激6小時(shí)和9小時(shí)顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)DKK1蛋白的表達(dá)(P0.05)。濃度梯度刺激6小時(shí),100mg/L ox-LDL刺激對(duì)DKK1蛋白的上調(diào)達(dá)到峰值(P0.05)。同時(shí),50mg/L和100mg/L ox-LDL刺激6小時(shí)能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞DKK1 mRNA水平(P0.05)。而100mg/L ox-LDL刺激9小時(shí),DKK1的上清水平顯著上調(diào)(P0.05)。2.經(jīng)典Wnt通路參與ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞中DKKl表達(dá)的調(diào)節(jié)與陰性對(duì)照組相比,β-catenin siRNA能夠顯著下調(diào)巨噬細(xì)胞中β-catenin及其靶基因CyclinD1的表達(dá)水平(P0.05)。同時(shí)ox-LDL刺激6小時(shí),對(duì)DKK1的上調(diào)作用被β-catenin干擾阻斷,表明經(jīng)典Wnt通路參與ox-LDL對(duì)DKK1的上調(diào)作用。3.LXRa參與ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞中DKKl表達(dá)的調(diào)節(jié),而LXRβ參與與對(duì)照組相比,LXRs激動(dòng)劑T0901317、GW3965、22-(R)-OH能夠顯著阻斷ox-LDL對(duì)DKK1的上調(diào)作用(P0.05)。而LXRs抑制劑GGPP和22-(S)-OH能夠顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)DKK1的表達(dá)水平,同時(shí)LXRs抑制劑組與ox-LDL刺激組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與陰性對(duì)照組相比,LXRa干擾組中巨噬細(xì)胞中DKK1的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05)。而LXRP干擾卻不能上調(diào)巨噬細(xì)胞中DKK1的水平(P0.05)。4. ox-LDL下調(diào)巨噬細(xì)胞中LXRs與P-catenin的相互作用免疫共沉淀結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,ox-LDL不僅下調(diào)了巨噬細(xì)胞中LXRa與β-catenin的相互結(jié)合,同時(shí)亦減少了巨噬細(xì)胞中β-catenin與LXRβ的相互結(jié)合。結(jié)論(1) ox-LDL能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞中DKK1的表達(dá)；(2) ox-LDL能夠減少LXRa對(duì)β-catenin的抑制作用來上調(diào)DKK1的表達(dá)。研究背景Wnt信號(hào)通路是一條與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育有重要關(guān)系的信號(hào)通路,近年來在心血管領(lǐng)域的研究越來越受到人們的關(guān)注。DKK1作為經(jīng)典Wnt通路的分泌型抑制劑,除了參與調(diào)節(jié)皮膚色素和厚度、骨骼的形成及穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)退行性疾病、脂質(zhì)代謝等,DKKl在心血管疾病中的作用也不容忽視。DKK1不僅影響心肌細(xì)胞、心臟瓣膜等多種心血管成分的生成,還可以促進(jìn)主動(dòng)脈內(nèi)皮的的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,同時(shí)DKK1可以增加內(nèi)皮和血小板之間的炎癥反應(yīng),發(fā)揮促動(dòng)脈粥樣硬化和增加斑塊易損性的作用。DKK1與脂肪代謝存在著密不可分的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),DKK1能夠促進(jìn)脂肪生成的過程,同時(shí)發(fā)現(xiàn)可源于脂肪細(xì)胞分布異常的成人肥胖,其脂肪生成過程異常主要由于經(jīng)典Wnt通路的異常活化和低水平的DKK1所致。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中DKK1與巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝功能是否存在著一定的聯(lián)系未見報(bào)道。巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)變?yōu)榕菽?xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中起到了重要的作用。巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝主要分為脂質(zhì)的吞噬、轉(zhuǎn)化和排出三個(gè)過程來維持其穩(wěn)態(tài)和平衡。巨噬細(xì)胞通過胞膜受體識(shí)別攝取脂蛋白和脂蛋白顆粒,并運(yùn)送到溶酶體后被分解為氨基酸及游離膽固醇。繼而酯酰輔酶A膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(ACAT)將其轉(zhuǎn)化為膽固醇酯儲(chǔ)存在胞質(zhì)中。當(dāng)膽固醇接收體如HDL, apoA-Ⅰ等存在時(shí),胞內(nèi)的游離膽固醇可經(jīng)過胞膜上的受體ABCA1、ABCG1等外流,減少胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)過度沉積。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中DKK1與巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝功能是否存在著一定的聯(lián)系未見報(bào)道。研究目的：(1)明確DKK1對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用；(2)明確經(jīng)典Wnt通路在DKK1調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中發(fā)揮的作用；(3)明確巨噬細(xì)胞中DKK1對(duì)脂質(zhì)受體LOX-1和ABCA/G1的調(diào)節(jié)及相關(guān)信號(hào)通路。研究方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)使用的THP-1細(xì)胞系為單核／巨噬細(xì)胞系,購自美國ATCC中心。將PMA加入培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁生長,成為THP-1來源的巨噬細(xì)胞。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染DKK1、β-catenin和STAT3的siRNA和陰性對(duì)照Negative control siRNA均由上海吉瑪公司合成,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染,具體步驟參照Lipo-2000的說明書進(jìn)行。3.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)刺激結(jié)束后RIPA裂解液提取蛋白,加入5×蛋白上樣緩沖液,煮沸,SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育4℃過夜,洗去附著的一抗,對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育,洗去附著的二抗,化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)相應(yīng)的蛋白灰度值。4.細(xì)胞油紅O染色刺激結(jié)束后,4%甲醛固定細(xì)胞,使用配制的油紅O工作液染色10分鐘,洗去浮色,蘇木素染核2分鐘,鹽酸酒精分化15秒,置于清水中返藍(lán)7分鐘,甘油明膠封片短期保存,并拍照統(tǒng)計(jì)脂質(zhì)沉積情況。5. Dil-ox-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)給予細(xì)胞不同刺激后加入Dil-ox-LDL孵育過夜,避光棄去培養(yǎng)基,4%甲醛固定,1×PBS洗去附著的甲醛,DAPI染核8分鐘,1×PBS沖洗細(xì)胞,防熒光淬滅劑封片,共聚焦顯微鏡549nm激發(fā)波長下檢測(cè)熒光強(qiáng)度,統(tǒng)計(jì)Dil-ox-LDL吞噬情況。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示,兩組之間的統(tǒng)計(jì)分析采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多組之間的統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析,P0.05代表統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。研究結(jié)果1.DKKl抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積與陰性對(duì)照組相比,DKK1干擾組油紅O染色結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)沉積顯著增加(P0.05)。與空白對(duì)照組相比,rDKKl顯著降低了巨噬細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)沉積(P0.05)。Dil-ox-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與陰性對(duì)照相比,DKKl干擾組顯著上調(diào)了巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)吞噬能力(P0.05),而rDKK1組的熒光強(qiáng)度則顯著低于空白對(duì)照組(P0.05)。以上結(jié)果表明DKK1能夠抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。2.Wnt通路參與DKK1對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積的抑制作用與陰性對(duì)照組相比,DKK1干擾組的(β-catenin水平顯著上調(diào),而P-β-catenin水平顯著下調(diào)(P0.05)。相反,rDKK1能夠阻斷ox-LDL對(duì)P-catenin的上調(diào)和P-β-catenin的下調(diào)作用(P0.05)。與陰性對(duì)照組相比,β-catenin干擾組的油紅O強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度均顯著下調(diào)(P0.05)。表明抑制經(jīng)典Wnt通路可以減少巨噬細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。3.DKKl通過抑制經(jīng)典Wnt通路下調(diào)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)受體LOX-1的表達(dá)rDKK1能夠顯著逆轉(zhuǎn)ox-LDL對(duì)LOX-1的上調(diào)作用(P0.05)；與陰性對(duì)照組相比,DKK1干擾組能夠顯著上調(diào)LOX-1的表達(dá),進(jìn)一步加強(qiáng)ox-LDL對(duì)LOX-1的上調(diào)作用(P0.05)；與陰性對(duì)照組相比,β-catenin干擾能夠阻斷ox-LDL上調(diào)巨噬細(xì)胞LOX-1的表達(dá)情況(P0.05)。4.DKKl通過活化STAT3通路上調(diào)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)受體ABCA/G1的表達(dá)與空白對(duì)照組相比,rDKK1刺激10-30分鐘能夠顯著上調(diào)P-STAT3的表達(dá),活化STAT3通路(P0.05)。與空白對(duì)照組相比,rDKK1能夠顯著上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達(dá)(P0.05)；而在加入STAT3抑制劑逆轉(zhuǎn)rDKK1對(duì)ABCA1和ABCG1的上調(diào)作用(P0.05)；與陰性對(duì)照組相比,STAT3干擾組能夠阻斷rDKK1對(duì)ABCAl的上調(diào)作用(P0.05)。結(jié)論(1)DKK1能夠抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積；(2)DKK1通過抑制Wnt/β-catenin通路下調(diào)LOX-1的表達(dá)；(3)DKKl通過活化STAT3通路上調(diào)ABCA/G1的表達(dá)。研究背景自噬(Autophagy)是真核生物進(jìn)化過程中相對(duì)保守的生命現(xiàn)象,是指細(xì)胞利用溶酶體水解酶水解細(xì)胞內(nèi)容物的過程,分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。巨自噬是指在饑餓等環(huán)境因素刺激下,胞質(zhì)內(nèi)形成雙層膜結(jié)構(gòu)將胞質(zhì)內(nèi)容物包裹運(yùn)送至溶酶體被水解酶降解的過程；而微自噬是指溶酶體直接吞噬胞質(zhì)內(nèi)容物清除的現(xiàn)象；分子伴侶介導(dǎo)的自噬,是指在分子伴侶的協(xié)助下,胞內(nèi)容物被運(yùn)送至溶酶體降解的現(xiàn)象。自噬能夠影響細(xì)胞的生存,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。一方面在早期腫瘤中自噬能夠阻斷腫瘤的發(fā)生,而抑制自噬水平會(huì)導(dǎo)致腫瘤的惡化；另一方面的腫瘤成熟后過快的生長、缺血,導(dǎo)致腫瘤內(nèi)環(huán)境惡劣,誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,作為對(duì)周圍不良環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng),此時(shí)的自噬會(huì)降解壞死的細(xì)胞器等胞內(nèi)容物,阻止腫瘤細(xì)胞的凋亡壞死,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。自噬的本質(zhì)是一種膜運(yùn)輸系統(tǒng),能夠形成雙層膜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)胞內(nèi)物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),存在一種自噬小體能夠?qū)|(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)運(yùn)送至溶酶體降解,稱為自噬脂小體(Lipophagy)。胞質(zhì)內(nèi)的自噬小體與脂滴融合形成自噬脂小體后,移動(dòng)到溶酶體處與之結(jié)合形成自噬脂滴溶酶體,其中的膽固醇酯在溶酶體中被降解為游離的膽固醇,并通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)出胞外。研究表明,Wnt/β-catenin通路對(duì)于基礎(chǔ)狀態(tài)和應(yīng)激狀態(tài)下的自噬水平均起到負(fù)調(diào)控的作用；而自噬活化時(shí)β-catenin能夠發(fā)生自噬性降解來抑制Wnt通路,形成一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)。然而自噬在DKK1對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著的作用尚未見報(bào)道。研究目的(1)明確DKK1對(duì)巨噬細(xì)胞中自噬水平的影響；(2) 明確自噬水平的改變是否參與DKK1對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)使用單核/巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)胞。將THP-1細(xì)胞種板后,以PMA誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?.細(xì)胞轉(zhuǎn)染DKK1 siRNA、ATG5 siRNA和Negative control siRNA均由上海吉瑪公司合成,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染步驟按照Lipo-2000說明書進(jìn)行。3.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)給予不同刺激后RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白,煮沸,SDS-PAGE電泳,按照對(duì)應(yīng)的分子量切膠,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,封閉,4℃一抗孵育過夜,洗膜,室溫二抗孵育1小時(shí)20分鐘,洗膜,化學(xué)發(fā)光法發(fā)光,分析蛋白條帶灰度。4.巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)給予不同刺激后,加入ac-LDL刺激過夜,4%甲醛固定30分鐘,油紅O工作液染色10分鐘,洗去浮色,蘇木素染核2分鐘,鹽酸酒精去分化15秒,置于清水中返藍(lán)7分鐘后,甘油明膠封片,拍照并統(tǒng)計(jì)胞質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)沉積情況。細(xì)胞給予不同刺激后,加入Dil-ac-LDL避光孵育過夜,棄去培養(yǎng)基,1×PBS沖洗細(xì)胞,4%甲醛固定,1×PBS沖洗細(xì)胞,DAPI染核8分鐘,1×PBS沖洗細(xì)胞,抗熒光淬滅劑封片,共聚焦顯微鏡549nm激發(fā)波長下檢測(cè)熒光強(qiáng)度,以檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)Dil-ac-LDL的吞噬能力。5.免疫共沉淀給予不同刺激后,Western及IP細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白,留取部分裂解液,加入5×蛋白上樣緩沖液,煮沸留作對(duì)照。加入50%瓊脂糖磁珠和適當(dāng)濃度的一抗原液,4℃孵育過夜,清洗磁珠,加入2×蛋白上樣緩沖液煮沸,留取上清,Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的含量。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組之間的統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析,P0.05代表統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。研究結(jié)果1.DKKl上調(diào)巨噬細(xì)胞中自噬的水平本研究以檢測(cè)巨噬細(xì)胞中自噬的標(biāo)志性分子LC3-II的表達(dá)來評(píng)估自噬水平�；A(chǔ)水平的細(xì)胞中LC3-Ⅱ的表達(dá)水平較低,當(dāng)加入自噬誘導(dǎo)劑px-LDL、 Rapamycin和EBSS時(shí),LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯升高,同時(shí)加入rDKK1能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)的LC3-II表達(dá)水平(P0.05)。但使用DKK1 siRNA干擾巨噬細(xì)胞中DKKl的表達(dá)時(shí),與陰性對(duì)照組相比,自噬誘導(dǎo)劑升高的LC3-II水平被顯著下調(diào)(P0.05),甚至低于基礎(chǔ)水平。使用自噬的抑制劑3-MA和LY294002時(shí),:DKK1上調(diào)的LC3-Ⅱ表達(dá)被顯著下調(diào)(P0.05)。2.DKKl通過上調(diào)自噬水平來抑制巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積與rDKKl刺激組相比,加入3-MA阻斷自噬水平后,胞質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)沉積顯著增加；與rDKKl刺激的陰性對(duì)照組相比,ATG5干擾組的胞內(nèi)脂質(zhì)沉積也恢復(fù)到了基礎(chǔ)水平(P0.05)。Dil-ac-LDL結(jié)果顯示,使用3-MA和ATG5小干擾后,rDKKl對(duì)巨噬細(xì)胞的Dil-ac-LDL吞噬的抑制作用被逆轉(zhuǎn)(P0.05)。3.DKKl通過上調(diào)自噬水平來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)受體的表達(dá)在rDKKl刺激的同時(shí)加入3-MA和ATG5小干擾下調(diào)巨噬細(xì)胞自噬水平時(shí),與單純r(jià)DKK1刺激組相比,LOX-1的水平有所上調(diào)(P0.05),而ABCA1的水平分別下調(diào)71%(3-MA組)和68%(ATG5干擾組),ABCG1僅下調(diào)20%(3-MA組)和34%(ATG5干擾組)(P0.05)。4.DKK1能夠通過自噬化降解下調(diào)巨噬細(xì)胞中的β-catenin的水平與空白對(duì)照組相比,rDKKl顯著下調(diào)巨噬細(xì)胞中β-catenin的水平,而使用了蛋白酶體抑制劑MG-132和自噬抑制劑3-MA時(shí),rDKKl對(duì)β-catenin的下調(diào)作用被阻斷(P0.05)。同時(shí)與陰性對(duì)照組相比,加入rDKK1組下調(diào)β-catenin的水平,ATG5干擾后rDKK1刺激組的β-catenin的水平顯著上調(diào)(P0.05)。免疫共沉淀結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,rDKK1刺激組LC3B與β-catenin的表達(dá)水平均上調(diào),表明rDKKl上調(diào)巨噬細(xì)胞中LC3B與β-catenin的結(jié)合。結(jié)論(1)DKK1能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞的自噬水平來抑制脂質(zhì)代謝；(2)DKK1通過自噬調(diào)節(jié)脂質(zhì)受體LOX-1和ABCA/G1的表達(dá)。(3)DKK1能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞中β-catenin的自噬化降解。
【關(guān)鍵詞】：氧化型低密度脂蛋白 DKK1 β-catenin 肝臟X受體α DKK1 脂質(zhì)代謝 凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1 三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A/G1 DKK1 自噬 脂質(zhì)代謝
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 前言8-10
• 中文摘要Ⅰ10-14
• 英文摘要Ⅰ14-19
• 符號(hào)說明Ⅰ19-21
• 論文I Ox-LDL調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞DKK1的表達(dá)及相關(guān)分子機(jī)制21-54
• 前言21-23
• 1. 材料與方法23-36
• 2. 結(jié)果36-38
• 3. 討論38-42
• 4. 結(jié)論42-43
• 附圖43-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 中文摘要Ⅱ54-58
• 英文摘要Ⅱ58-63
• 符號(hào)說明Ⅱ63-65
• 論文Ⅱ DKK1抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及相關(guān)脂質(zhì)受體的變化65-97
• 前言65-66
• 1. 材料與方法66-76
• 2. 結(jié)果76-78
• 3. 討論78-82
• 4. 結(jié)論82-83
• 附圖83-89
• 參考文獻(xiàn)89-97
• 中文摘要Ⅲ97-101
• 英文摘要Ⅲ101-106
• 符號(hào)說明Ⅲ106-107
• 論文Ⅲ DKK1對(duì)巨噬細(xì)胞自噬水平的影響及其調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用107-133
• 前言107-108
• 1. 材料與方法108-115
• 2. 結(jié)果115-117
• 3. 討論117-121
• 4. 結(jié)論121-122
• 附圖122-127
• 參考文獻(xiàn)127-133
• 致謝133-134
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文134-135
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表135-136
• 英文論文Ⅰ136-160
• 英文論文Ⅱ160-173

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  本文關(guān)鍵詞：DKK1抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及其相關(guān)分子機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：349469